Alta resolución todo el montaje de<em> In Situ</em> La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función
Summary
El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar mediante<em> In situ</em> Hibridación. Nuestro protocolo mejorado permite la detección de bajos abundantes transcripciones con baja señal de fondo no específica.
Abstract
Este artículo se centra en todo el montaje hibridación in situ (deseo) de embriones de pez cebra. La tecnología DESEO facilita la evaluación de la expresión génica tanto en términos de distribución en los tejidos y la etapa de desarrollo. Los protocolos se describen para el uso de la voluntad de embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina. Las sondas se generan mediante la incorporación de nucleótidos unidos a digoxigenina mediante transcripción in vitro de plantillas de genes que han sido clonados y linealizado. Los chorions de embriones cosechados en etapas de desarrollo definidas se eliminan antes de la incubación con sondas específicas. Siguiendo un procedimiento de lavado para eliminar el exceso de sonda, los embriones se incuban con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Mediante el empleo de un sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, la expresión de genes específicos puede ser evaluada. Dependiendo del nivel de la expresión génica todo el procedimiento puede ser completado dentro de 2-3 días.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de desarrollo de los vertebrados, la enfermedad, el comportamiento, y en la detección de drogas 1-3. Embriones de pez cebra se pueden obtener en grandes cantidades a partir de un solo cruce. La fertilización y el desarrollo se produce fuera del útero y los embriones ópticamente transparentes se desarrollan rápidamente. Eventos de desarrollo críticos se producen durante las primeras 48 horas después de la fecundación (HPF). Esto incluye la aparición de primordios de órganos y la iniciación de citodiferenciación. Desmontables o sobre-expresión de proteínas se puede lograr a través de la microinyección de embriones con antisentido morfolino (MO) oligonucleótidos o ARNm, respectivamente, a la una o dos etapas de células (0,75 HPF).
El deseo de los embriones de pez cebra facilita el estudio de la expresión espacio-temporal de los genes de interés. Aplicación de la técnica DESEO después de la microinyección de embriones con ARNm o MO a la sobre-exprESS o los niveles de proteína específicos desmontables revela regulación diferencial de otros genes.
Los cambios en los patrones de expresión de genes pueden ser correlacionados con los cambios fenotípicos y revelan la función de los genes diana durante la embriogénesis temprana. Dado que las sondas pueden prepararse y almacenarse de antemano, la técnica ISH se puede aplicar para revelar los patrones de expresión de genes por lo menos 20 genes a la vez el uso de placas de seis pocillos y las cestas hechas a medida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado métodos mejorados para visualizar ARN con alta resolución. La hibridación in situ en los procedimientos se llevan a cabo utilizando simples cestos hechos a medida con fondos porosos (Figura 1). Los embriones se procesaron utilizando soluciones libres de RNasa en placas de 6 pocillos a temperatura ambiente en condiciones estériles.
Para segregar embriones cestas están hechas de diferentes tubos Eppendorf de colores. Cestas con o sin un borde s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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