높은 해상도 전체 마운트<em> 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서> 하이브리드
Summary
제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될 수있다<em> 현장에서</em> 하이브리드. 우리의 향상된 프로토콜은 낮은 비 특정 배경 신호를 낮은 풍부한 성적 검출 할 수 있습니다.
Abstract
이 문서에서는 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화 (소원)의 전체 마운트에 초점을 맞추고 있습니다. 소원 기술은 조직의 분포와 발달 단계의 측면 모두에서 유전자 발현의 평가를 용이하게합니다. 프로토콜은 digoxigenin으로 표시 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 제브라 피쉬 배아의 소원의 사용을 설명합니다. 프로브는 복제와 선형화 된 유전자 템플릿의 시험 관내 전사의를 통해 digoxigenin 연결된 뉴클레오티드를 통합하여 생성됩니다. 정의 개발 단계에서 수확 배아의 chorions는 특정 프로브를 배양하기 전에 제거됩니다. 여분의 프로브를 제거하는 세척 절차에 따라 배아는 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 결합 된 항 digoxigenin 항체 배양한다. 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)에 대한 발색 기판을 채용하여, 특정 유전자의 발현을 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현의 수준에 따라 전체 절차는 2-3 일 이내에 완료 할 수 있습니다.
Introduction
제브라 피쉬 (Danio rerio)는 척추 동물의 개발, 질병, 행동의 연구를위한 강력한 동물 모델로 등장하고있는 약물 검사 1-3습니다. 제브라 피쉬 배아는 하나의 교차점에서 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 수정 및 개발 전 자궁 및 광학적으로 명확한 배아 신속하게 개발을 발생합니다. 중요한 발달 이벤트는 처음 48 시간 후 수정 (HPF) 동안 발생합니다. 이 기관 원기의 모양과 세포 분화의 시작을 포함합니다. 단백질의 최저 이상 발현은 안티센스 모르 (MO) 올리고 뉴클레오티드와 배아의 microinjection을 통해 달성하거나 하나 또는 두 개의 세포 단계 (825 HPF)에서 각각 mRNA의 할 수 있습니다.
제브라 피쉬 배아의 소원이 그 특정 유전자의 시공간적 표현의 연구를 용이하게합니다. 소원 기술의 응용 프로그램은 오버 EXPR을 발현 또는 MO와 배아의 microinjection에 따라ESS 또는 최저 특정 단백질 수준이 다른 유전자의 차등 규제를 보여준다.
유전자 발현 패턴의 변화는 표현형의 변화와 상관 관계와 초기 형성기 동안 표적 유전자의 기능을 표시 할 수 있습니다. 프로브를 준비하고 사전에 저장 될 수 있기 때문에, ISH 기법은 6 잘 접시와 사용자 정의 만든 바구니를 사용하여 한 번에 적어도 20 유전자의 유전자 발현 패턴을 나타 내기 위해 적용 할 수 있습니다.
Protocol
1. 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트 배아의 1.1 준비 필요한 발달 단계에서 배아를 수집합니다. 배아 단계에 대한 설명은 킴멜 등 5.를 참조하십시오. 수동 집게 (뒤몽 시계 제조는 않습니다. 5 포셉 없음)를 사용 chorions를 제거합니다. PBS에서 만든 파라 포름 알데히드의 4 % 용액 (PFA)?…
Representative Results
바구니 당 50 배아 (유전자 당 / 실험 조건 당)이 유전자의 발현 패턴이 하나의 실험에서 얻을 수와 프로토콜을 사용하여. 거의 모든 배아는 특정 유전자와 유사한 발현 패턴을 보여줍니다. 원위치 하이브리드 염색의 대표적인 예는 그림 3-6에 표시됩니다. 감각과 안티 센스 모두 riboprobes은 PC5.1에 해당하는 cDNA를, PC5.2 6 SCL/tal-1 7, GATA-1 …
Discussion
우리는 높은 해상도로 RNA를 시각화하는 개선 된 방법을 개발했습니다. 현장 하이브리드 절차는 다공성 바닥 (그림 1) 간단한 사용자 정의 – 만든 바구니를 사용하여 수행됩니다. 배아는 무균 조건 하에서 상온에서 6 – 웰 플레이트에서 RNase가없는 솔루션을 사용하여 처리됩니다.
분리 할 배아 바구니는 다른 색깔 에펜 도르프 튜브에서 만들어집니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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Cite This Article
Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. J. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).