基于聚苹果酸的纳米药物的一个例子,提出对个性化的药物,适用于癌症的合理设计。它描述了一种纳米药物来治疗HER2阳性乳腺癌裸鼠的合成。
Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.
在后基因组时代,癌症基因组已被揭开( 美国国家生物技术研究中心和癌症基因组图谱 ),癌症治疗的未来将占到肿瘤的遗传多样性往往在同一肿瘤1-4。生物信息学和快速的,不买贵的DNA测序允许收购的恶性基因/基因突变在个人层面上2,4,5。一旦该基因已被确定,病人会被个性化医学修改或沉默的恶性6基因表达的治疗。瞄准癌细胞,并提供药物进入这些细胞需要呼吁多功能输送系统。显然,纳米药物可以达到这个要求7。
在发现的怒涛纳米粒子已被证明适合于携带的化疗药物,蛋白质和/或基因的活性物质对癌细胞的有效载荷。然而,不利的影响仍然是广告穿着。其中之一有关的情况下的生物降解性,可能会造成材料的沉积在健康组织和器官惹病的可能性。为了最大限度地减少沉积,我们介绍了无毒和无免疫原性聚苹果酸,这是微生物来源的和可生物降解的,以H 2 O和CO 2 8。我们使用的聚合物,合成的纳米药物的所有功能于一身的共价键类型。它包含化学连接的化疗剂如替莫唑胺,阿霉素,或反义寡核苷酸和服务外渗,组织靶向,溶内体递送的官能团。该药物从本质纳米平台切割时,他们来到了有针对性的肿瘤细胞,从而再生其全部药品的活动。
我们描述了微生物生产的聚合物纳米平台的方法,其纯化,化学合成的纳米药物,它包含曲妥珠单抗(赫赛汀),用于癌症靶向和反义寡核苷酸用于治疗HER2过量的抑制。在应用纳米药物异种人Her2阳性乳腺癌裸鼠,我们证明了癌症治疗的疗效高。肿瘤靶向和基因沉默引入这里供聚苹果酸纳米药物的原理可以在癌症的其他情况下,处理被应用。
实验途径的纳米药物从可生物降解的天然聚合物的制备提出了可在个性化药物的合成中使用。的描述开始,聚苹果酸,这是纳米药物合成一个多功能平台的受控生产和纯化。使用可重复的方法,获得具有高的分子量和在适合于药物合成极端纯度的聚合物。该合成被描述为示出能够有效地治疗HER2阳性乳腺癌的纳米药物。的描述可以被翻译成其他大多数纳米药物治疗癌症的合成。靶向涉及抗体,如赫赛汀结合肿瘤特异性抗原诸如HER2蛋白或任何其他肿瘤标记物被有效地内在化。纳米药物提供了一个选择反义寡核苷酸和化学治疗剂的,这将有效地特雷下抑制癌细胞的生长atment。在这个例子中,赫赛汀结合HER2和具体的反义寡核苷酸退火与HER-2编码的mRNA,导致在HER2信号和重度减低HER2阳性乳腺癌的持续封锁。基于肿瘤靶向和反义寡核苷酸抑制基因表达的基本原则,我们最新合成的其他几个纳米药物,并成功抑制潜伏期人类胶质母细胞瘤和三阴性乳腺癌11,14-18。
合成工作开始于高度纯化的纳米药物的平台,这是从多头绒泡菌 (一个物种的“粘菌”家庭)的培养上清聚苹果酸的制备。制备强调了聚合物的高分子量的,原则上,允许附着大量的抗体,肽,寡核苷酸和其他分子的活性药物输送和肿瘤生长的抑制中起作用。 Followi纳克受控的培养和纯化,聚合物在可预见的产率可再现的质量已经产生。该聚合物被存储方便的条件下进行的任何时间。
的PMLA纳米缀合物与聚合物侧基羧酸的化学活化开始的合成是在几个合成步骤。在步骤之间,合成可任选地被搁置,允许制备的任意数量的中间产物,因此可用于在向上缩放。合成的进展之后是TLC和SEC-HPLC,和纳米药物的两种组合物和活性是由特定组的定量化学分析,酶联免疫吸附,以及各种物理测量的控制。我们的经验是,这些合成已经进展顺利,可重复具有优良的产率和纯度。通过选择抗体和反义寡核苷酸的特异性纳米药物的任何变体可以根据需要在PE是有利合成rsonalized药。
成功治疗人类的HER2阳性乳腺癌的模式是用于制备小鼠癌症模型,应用纳米药物,成像和肿瘤生长的分析有效的代表。 在体外生存力试验的结果是在选择的细胞系和领先的药物在动物实验中使用是有用的。 体内精诺成像验证该纳米药物确实递送到肿瘤。蛋白质印迹分析的结果揭示了是否在预测方式在癌症治疗期间的某些蛋白质的水平响应。肿瘤大小的测量通知关于治疗的成功, 即约抑制作用,衰退或消退。所描述的实施例反映了我们和其它聚苹果酸为基础的纳米药物指示的可预测性,再现性和不存在显着的毒性程度高的经验。对毒性和多个T近期疗效结果argeted聚苹果酸结合物为三阴性乳腺癌的治疗都是在这个概念18的大力支持。一个主要特点是,我们的纳米药物能够穿透生物障碍:内皮屏障由外渗进入肿瘤间质,由核内体摄取的肿瘤细胞膜,并通过亮氨酸乙基酯或trileucine组的动作核内体膜破裂。外渗和核内体摄取被可靠地连接到所述纳米药物的特异性抗体来实现。抗小鼠转铁蛋白受体的抗体介导高效涌入肿瘤由转作用,可能是因为该受体的过度表达于大多数肿瘤脉管系统。不同的抗体附着在纳米相同共轭分子的功能在具体指导纳米药物进入收件人的肿瘤细胞。两种抗体的存在下,在一个用于转作用,另一种为核内体摄取,是最佳的运转是必不可少的。 m的定量分析ALIC酸和抗体强烈建议,以便控制所述纳米药物的最佳组合物。最后,应当指出的是,所有功能于一身的共价纳米药物通过主机脉管到受体的肿瘤细胞提供了药物在化学连接形式的途中 。化学附着使得大多数药物无效的(前体药物),直到它们被从纳米复合平台在目标部位裂解重组为游离药物。这是重要的,因为活化形式提供传送和最小的机会,以唤起有害的副作用时的安全高度。多功能性,有效性和安全性都不错的个性化医学的不可缺少的属性。
The authors have nothing to disclose.
We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
Herceptin | Genentech | 15534 | |
Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
SPDP | Proteochem | C1116 | |
Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
Dexmedetomidine | Pfizer | ||
Atipamezole | Pfizer | ||
Carprofen | Pfizer | ||
Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |