Et eksempel på en nano stoff basert på polymalic syre er presentert mot den rasjonelle utforming av personlig medisin som er anvendbar til kreft. Den beskriver syntesen av et nano medikament til behandling av HER2-positiv human brystkreft i en naken mus.
Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.
I det post-genomisk æra når genomer av kreft har blitt avslørt (National Center for Biotechnology and The Cancer Genome Atlas), vil fremtidig behandling av kreft står for genetisk mangfold av svulster ofte innenfor samme svulst 1-4. Bioinformatikk og rask, ikke dyrt DNA-sekvensering tillater kjøp av ondartede gener / mutasjoner på et personlig nivå 2,4,5. Når gener har blitt identifisert, vil pasienter bli behandlet med personlig medisin å endre eller taushet deres uttrykk for ondartede gener seks. Behovet for å målrette mot kreftceller, og å levere medikamenter inn i disse celler krever polyfunksjonelle leveringssystemer. Selvfølgelig, kan nano narkotika oppfylle dette kravet 7.
I en bølgende bølge funn nanopartikler har vist seg egnet til å bringe nyttelast på kjemoterapeutiske legemidler, proteiner og / eller genetisk aktivt materiale til kreftceller. Men bivirkninger fortsatt å være annonsekledd. En av dem er relatert til fraværet av biologisk nedbrytbarhet kan forårsake avsetning av materiale i friskt vev og organer med en sannsynlighet for å fremkalle sykdommer. For å minimalisere avsetning, innførte vi ikke-toksisk og ikke-immunogen polymalic syre, som er av mikrobiell opprinnelse og biologisk nedbrytbare til H2O og CO2 8.. Vi bruker polymer å syntetisere en alt-i-ett kovalente type nano narkotika. Den inneholder kjemisk festet chemotherapeutics som Temozolomide, doxorubicin, eller antisense oligonukleotider og funksjonelle grupper som serverer bloduttredelse, vev målretting, endosomolytic levering. Stoffet er egentlig spaltes fra nano-plattformen da de kom i målrettede svulst celle, dermed gjenoppfriske sin fulle farmasøytisk aktivitet.
Vi beskriver en fremgangsmåte for mikrobiologisk fremstilling av polymeren nano-plattform, dens rensing og kjemisk syntese av et nano medikament som inneholder Trastuzumab (Herceptin) for cancermålretting og et antisens-oligonukleotid for inhibering av HER2-overproduksjon. Ved anvendelse av nano stoffet til xenogeneiske human HER2-positiv brystkreft på nakne mus, vi demonstrere høy effekt av kreftbehandling. Prinsippene for tumor målretting og genet stanse innført her polymalic syre nano stoffer kan anvendes ved behandling av andre tilfeller av kreft.
Den eksperimentelle rute for fremstillingen av nano medikamenter fra en biologisk nedbrytbar polymer som naturlig er presentert som kan brukes i syntesen av personlig medisin. Beskrivelsen starter med kontrollert produksjon og rensing av polymalic syre, som er en allsidig plattform for nano medikament syntese. Ved hjelp av reproduserbare teknikker, er polymeren oppnådd med høy molekylvekt, og i ekstreme renhetsgrad egnet for farmasøytisk synteser. Syntesen er beskrevet for en nano medikament som er vist å effektivt behandle HER2-positiv brystkreft. Beskrivelsen kan oversettes til synteser av de fleste andre nano legemidler for behandling av kreft. Targeting omfatter antistoffer som Herceptin som binder en tumorspesifikt antigen som HER2 protein eller enhver annen tumormarkør som er effektivt internalisert. Nano stoffet gir et utvalg av antisens-oligonukleotider og kjemoterapeutika som vil effektivt hemme veksten av kreft under treling. I eksemplet, Herceptin binding til HER2 og spesifikk antisens oligonukleotid annealing med HER2-kodende mRNA resulterte i forlenget blokkering av HER2-signalisering og alvorlig reduksjon av HER2-positiv brystkreft. Basert på det underliggende prinsippet om svulst målretting og hemming av genuttrykk ved antisens oligonukleotider har vi to-date syntetisert flere andre nano narkotika og hell hemmet preklinisk human glioblastom og trippel-negative brystkreft 11,14-18.
Den syntetiske arbeidet starter med fremstilling av sterkt renset nano medikament plattformen, som er polymalic syre fra kultursupernatanten av Physarum polycephalum (en art av "slam mold"-familien). Fremstillingen streker høye molekylvekter av polymeren i prinsippet tillater feste av en rekke antistoffer, peptider, oligonukleotider og andre molekyler som fungerer i den aktive medikamentavgivelse, og tumorvekst inhibering. Following den kontrollerte dyrkning og rensing, og reproduserbar kvalitet av polymer i forutsigbare utbytter blitt produsert. Polymeren er lagret under praktiske forhold for ethvert tidspunkt.
Syntesen av PMLA nano konjugater som begynner med den kjemiske aktiveringen av polymer-anheng karboksylater er utført i et par syntetiske trinn. I mellom trinnene, kan syntesen være eventuelt sperres slik at fremstilling av vilkårlige mengder av mellomprodukter, og således kan brukes i opp skalering. Fremdriften av syntesen blir etterfulgt av TLC, og sec-HPLC, og at både sammensetning og aktivitet av nano medikament kontrolleres ved gruppespesifikke kvantitative kjemiske analyser, ELISA, og en rekke fysiske målinger. Vår erfaring er at disse syntesene har blitt kommet jevnt og reproduserbart med gode avlinger og renhet. Ved å velge spesifisiteten av antistoff og antisense oligonukleotider noen variant av nano stoffet er gunstig syntetisert som trengs i personalized medisin.
Nærmere regler for vellykket behandling av human HER2-positiv brystkreft er gyldige representanter for utarbeidelse av mus kreft modeller, anvendelse av nano narkotika, bildebehandling, og analyse av tumorvekst. Resultatene av in vitro-levedyktighets tester er nyttige i å velge cellelinjen og den ledende stoff som skal brukes i dyreforsøk. In vivo Xenogen avbildning bekrefter at nano stoffet er faktisk leveres inn i svulsten. Resultater av western blotting avslører om nivået på visse proteiner svarte i den anslåtte mote under kreftbehandling. Måling av tumorstørrelse informerer om suksessen til behandling, det vil si om hemming, resesjon eller regresjon. Det beskrevne eksempel viser vår erfaring med andre polymalic nano stoffer syrebaserte indikerer en høy grad av forutsigbarhet, reproduserbarhet og fravær av betydelige toksisitet. Nyere resultater på giftighet og effekt av flere targeted polymalic syre konjugater for trippel-negative brystkreft behandling er i sterk støtte for denne oppfatningen 18. Et viktig trekk er at vår nano stoffet er i stand til å trenge gjennom bio-barrierer: endothelial barriere ved uttredelse inn i tumor interstitiell, tumorcellemembran ved endosome opptak, og endosome membran avbrudd under innvirkningen av de leucin-ethylester eller trileucine grupper. Ekstravasering og endosome opptak blir på en pålitelig måte oppnås ved de spesifikke antistoffer som er festet til nano stoffet. Anti-mus-transferrin-reseptor antistoff medierer effektiv innstrømning inn i svulsten etter transcytosis, sannsynligvis fordi reseptoren er overuttrykt i de fleste tumor vaskulatur. Et annet antistoff som er festet på de samme nano konjugerte molekyl funksjoner spesifikt dirigere nano stoffet inn i mottakeren tumorcelle. Tilstedeværelsen av begge antistoffer er en for transcytosis og den andre for endosome opptak, vesentlig for optimal funksjon. Kvantitativ analyse av malic syre og antistoffet er sterkt anbefalt for å kontrollere en optimal sammensetning av nano stoffet. Endelig skal det bemerkes at alt-i-ett-kovalente nano medikament leverer medikamentet i kjemisk bundet til, danner en rute gjennom verts vaskulaturen inn i mottageren tumorcelle. Kjemisk vedlegget gjengir de fleste medikamenter inaktive (prodroger) før de er rekonstituert som gratis narkotika ved spalting fra nano konjugert plattformen ved målrettede området. Dette er viktig fordi den reaktive modalitet gir en høy grad av sikkerhet under levering og en minimal sannsynlighet for å fremkalle skadelige bivirkninger. Allsidighet, effekt og sikkerhet er uunnværlige kjennetegn på god personlig medisin.
The authors have nothing to disclose.
We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
Herceptin | Genentech | 15534 | |
Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
SPDP | Proteochem | C1116 | |
Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
Dexmedetomidine | Pfizer | ||
Atipamezole | Pfizer | ||
Carprofen | Pfizer | ||
Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |