在导游的带领下物料的筛分方法来开发溶胶凝胶蛋白掺杂微阵列使用一个新兴的销印刷法制造。这种方法是通过发展的乙酰胆碱酯酶和的多激酶芯片,用于成本效益的小分子筛选证明。
芯片已发现使用高通量检测新材料和新发现的小分子药物先导的发展。本文中,我们描述了一种引导物料的筛分的方式来确定基于溶胶 – 凝胶的材料,适合用于生产三维蛋白质微阵列。该方法首先识别微阵列,它可以打印的材料,材料的吞吐量是与一个给定的酶测定兼容,然后锤炼的最佳材料的基础上保留最大酶活性收缩的数目。这种方法的应用,开发适用于两种不同的酶检测,用乙酰胆碱酯酶和其他使用四个关键激酶参与癌症的一组微阵列。在每一种情况下,有可能产生,可用于定量小分子的筛选试验和生产的剂量依赖性的抑制响应曲线的微阵列。重要的是,有能力筛选许多队友里亚尔生产上的类型的材料,最适合两个微阵列的生产和酶的活性保留的信息。材料数据提供洞察基本材料的要求,必要的剪裁最佳,高密度的溶胶凝胶微阵列。
微阵列技术在科学界已经获得了普及,提高检测吞吐量作为一种方法。由于芯片技术的发展,以评估1基因的表达,在20世纪90年代中期,芯片已发现使用开发的高通量分析,以确定蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子的相互作用,并寻找新的材料,具有独特的性能。微阵列2-5最近,已开发其特征在于,特定的材料,用于固定功能的蛋白质,产生一个三维微阵列元素内的蛋白质包埋,允许简便测定酶活性和抑制的微阵列本身使用一个合适的荧光测定联接到基板周转。5-10,更重要的是,这样的微阵列可被设计为包括所有必需的组件到屏幕上的样品和对照一起在一个高度并行的方式。5,8 </ P>
蛋白质微阵列的早期例子通常使用标准的蛋白质固定化的方法,如共价连接到固相载体上,制备11亲和捕获3和物理吸附12的生物固定化虽然这些方法允许样品浓度增加和加速所需的反应动力学检测的小型化,他们每个人都遭受缺点。一般来说,所有导致的固有生物分子的功能,由于表面的化学改性的降低,阻碍了活性位点的访问,或不正确的取向,由于非特异性的固定化。因此,所有的方法在生物分子的沉积,虽然增加的响应,可能需要人为地结合到表面上的生物分子的产生是由于在较低的检测灵敏度的结果。
一个新兴的用于生产功能性的生物分子的微阵列的方法是通过引脚印刷掺蛋白硅溶胶到固相载体上,这是典型要么功能的载玻片或个别井的微孔板。在室温下在含水环境中发生的溶胶-凝胶工艺本身,它是液体前体,进行打印,然后凝胶的坑害生物分子内的3D矩阵,允许高蛋白质:13,以及多个组件的包封内13,14裁缝的溶胶-凝胶衍生的材料可以通过仔细选择不同的氧化硅前体,以及通过改变含水组分通过使用不同的缓冲液(pH,离子强度),列入相同的微阵列元件。各种添加剂(聚合物,小分子),以达到一个最佳的材料,其中的特定性质取决于包埋的生物分子。
一个潜在的局限性与发展中国家通过溶胶凝胶蛋白质芯片引脚印刷相关需要确定溶胶-凝胶基复合材料销无凝胶,它可以打印或显示不良属性(不可再生的光斑尺寸,开裂,附着力差,与检测组件不兼容,蛋白活性较差)一次印刷表面上。同时所有这些参数的最优化排除了可以设计新的方法,其特征在于材料,或以串行方式慢慢地检查。另一方面,随机筛选的几千或几十万材料既不是时间,也不符合成本效益的。
在本文中,我们描述了一种直接筛选方法,使随机筛选大量的材料,而不需要采用合适的材料,用于生产蛋白质微阵列的快速鉴定。采用引导的方法,首先确定适合芯片印刷材料,随后通过了一系列小规模的屏幕,识别最佳的溶胶凝胶材料人的组合,可再现地打印,不开裂,是与一个给定的检测兼容。最后,最佳的材料的基础上确定保留酶的活性和性能在最后的小分子筛选方法。在这种方式中,最佳的材料可以被识别从无数使用只有几百测定步骤的候选人。我们证明这种方法制造的两个高密度的乙酰胆碱酯酶和多激酶微阵列,使用这样的微阵列的小分子筛选。
这里描述的方法被选择为最合适的吞吐量接触打印机可打印的溶胶 – 凝胶衍生材料,制造时间和成本有效的程序的快速吞吐量最佳的材料,而无需筛选大量的材料。从共〜20,000的潜在材料,它是可能的,以确定〜200的材料,适合于单独的凝胶时间的基础上,打印。这大大减少了所需材料的数量要准备随后的印刷试验。这些可打印的材料,然后印刷到4个滑动面,总的768材料的滑动组合。平均而言,50点/复制的一种材料,可以打印〜3分钟,包括样品装载,现货沉积和引脚清洗。其中,155的材料,或大约20%,允许打印的点的最大数目每个溶液的吸收,并产生可再现的光斑尺寸。应该指出的是,4 sl的IDE表面测试,材料上印制的顺序为:胺>环氧树脂>醛> PMMA,PMMA幻灯片没有产生有用的阵列的任何材料。这可能是由于表面涂层的极性。比较,在上述的滑动表面,极性较大的胺和环氧,更适合的水溶胶相比,聚甲基丙烯酸甲酯的幻灯片。此外,胺包被的载玻片的测试表面,提供了一个潜在的正电的表面沉积的粘结阴离子溶胶。我们怀疑,二氧化硅纳米颗粒的界面处之间的滑动和沿表面的溶胶交互。环氧和醛的滑动表面缺乏相同的初始基于电荷的相互作用。为了确保最佳的现货沉积,强烈建议从供应商如Arrayit使用预涂幻灯片,。在内部涂层会产生不一致的表面,导致点再现性差13,在某些情况下,可能会导致量化概率的根源。18同样重要的,温度和湿度的影响“的印刷适性”的材料。虽然没有详细的与温度有关的影响进行了研究,始终进行印刷,在室温下(23±3℃)。湿度(大于80%)也被控制在打印室之内,以防止由于小的沉积量(0.7-2.3 nl)的和蒸发的不规则形状沉积。
虽然材质屏幕引向确定最佳的溶胶 – 凝胶衍生材料专为印刷乙酰胆碱酯酶和激酶,一小部分的材料进行鉴定,曾任职于这两种类型的蛋白质。事实上,两个被确定在激酶芯片制造的材料是基于SS + PVA +甘油,并于AChE的微阵列26选择的材料,这两种材料也被确认。这些“最佳”的材料可能会提供一个通用的起点,进一步发展PROTE掺杂溶胶 – 凝胶微阵列,并围绕这些组合物的小屏幕可以识别芯片制造的甚至更好的材料。第二点要注意的是所用的酶的重要性。乙酰胆碱酯酶(相当强大的酶)的情况下,保留原来的66确定检测兼容的材料26(或约40%),残存的乙酰胆碱酯酶的活性。然而,对于的更细腻激酶,只有2 69检测兼容的组合物,或大约3%的材料,能够保留所有的激酶的活性。当足够数量的不同的酶还没有被研究作出决定性的报表,它似乎与相对不稳定的酶的优化阵列制造,可能会导致鉴定的材料,可以截留广泛的蛋白质,能使芯片制造mutliplexed。
独立于所选择的蛋白,吞吐量可打印的材料的截止主要因素是需要相当长的材料的凝胶时间(2.5小时)。在开发基于SS的溶胶 – 凝胶材料时,这是非常重要的,以确保在离子交换和过滤后,该溶胶是在pH约为4。溶胶具有较低的初始pH值可能导致在材料以低于中性的pH值,这可能会影响酶的活性。19 DOWEX(离子交换树脂),对SS的量,可以改变最终的溶胶的pH值的调节。当一个新的批次的树脂制备的树脂对SS的比例需要调整以便产生溶胶协议的第2条中的程序后,在约pH值为4。
同样,结晶DGS的编制往往是错误的来源,相关的材料失效时,利用生物分子截留DGS基溶胶。虽然没有在这里详细报道,伟大的护理过程中要采取的合成结晶DGS,尤其需要避免的合成过程中水的存在,可以产生polyglycerated二氧化硅TES而非单体DGS。此外,由于DGS的吸湿性,结晶样品需要被存储的干燥的,合成后的6个月内使用。 6个月以上的结晶性DGS可能不完全溶解,即使在酸性环境下用超声处理(由于部分冷凝的聚甘油硅酸盐材料)。不完全的DGS解散溶胶未知和不可控的二氧化硅含量,因此,不太可靠的材料。
一个重要的一点要注意接触印刷质量的针脚。损坏或处理不当销( 图9)将不会产生重复性阵列正在打印的材料无关。建议检查使用解剖显微镜,以确保不使用破裂或堵塞销针质量。小心处理,确保使用寿命长的引脚。自由流动的引脚也很重要。在被困在打印头之间的头和脚,脚湿气的情况下,不会座椅正确和适当的接触,因而不会使配合面,导致在缺乏材料的沉积。
总之,我们已经提供了一个详细的,多步骤的筛选方法,发展高密度蛋白掺针印制的微阵列。甄别涉及优化材料性能(凝胶化时间和适印性),以允许识别兼容一个给定的检测,并能保留酶活性的材料,印刷材料,然后由更集中的筛选。本指导材料的筛选方法可以应用到其他微阵列格式,以减少时间和成本与生产效率的高密度微阵列。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢玛丽亚·蒙顿朱莉莱贝特的,源自:jessamyn小,葛昕和劳拉Lautens的协助开发蛋白质芯片。作者还感谢自然科学和工程研究理事会,加拿大(NSERC)为这项工作提供资金。作者还感谢加拿大基金会为支持这项工作的创新和安大略省创新信托。加多宝拥有加拿大研究主席在生物分析化学和生物界面。
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |