마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

Summary

마우스 유방 동맥에 수성 시약의 비 침습성 췌관 전달을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 특히 유방 덕트를 대상으로 유 방 땀 샘의 젖꼭지로 지역화 주입을 활용합니다. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제와 작은 분자를 포함한 화합물의 다양한 적응할 수있다.

Abstract

여기에서 우리는 췌관 내 주사를 통해 마우스의 유방 동맥에 여러 가지 시약을 제공 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 현지화 된 약물 전달 및 노크 다운 유방 상피 세포 내 유전자로 인해 이러한 임신과 수유 등의 발달 단계와 무관 한 적절한 표적 분자의 부족으로 달성하기 어렵다. 여기서, 우리는 생쥐의 젖꼭지에 췌관 내 주사를 통해 성년의 모든 단계에서 유선에 시약의 지역화 전달을위한 기술을 설명합니다. 주사 마취, 살아있는 쥐에서 수행하고, 유선에 대한 비 침습 및 지역화 된 약물 전달을 허용 할 수 있습니다. 또한, 주사​​는 유두를 손상하지 않고 몇 개월에 걸쳐 반복 될 수있다. 같은 에반스 블루 같은 중요한 염료 기술을 습득하는 것은 매우 도움이됩니다. 청색 염료의 췌관 주입하면, 전체 유관 나무는 눈에 보이지됩니다. 또한, 형광 표지 시약도 허용유선 내에서 시각화 및 유통. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제, 작은 분자를 포함하는 화합물의 다양한 적응할 수있다.

Introduction

마우스 유방 선은 젖꼭지에서 중앙 덕트에 수렴 복잡한 유관-폐포 나무로 구성되어있다. 마우스뿐만 아니라 인간, 유방 종양의 대부분은 우유 덕트 안감 상피 세포에서 유래. 현재 가능한 치료는 정맥 화학 요법, 방사선 및 수술을 포함한다. 현지화 된 췌관 치료는 ^1-3 탐구 감소 독성과 부작용의 측면에서 상당한 이점을 제공하고 있습니다. 이러한 널리 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 몇 가지 과제가 남아있다. 마우스 유방 동맥의 비교 절차를 수행 할 수있는 능력은 췌관 개입의 특성을 용이하게한다. 여기에 우리가 직접 마우스 유방 덕트에 시약의 전달을위한 비 침습적 인 방법을 제시한다.

유방암 환자와 마우스 모델 모두에서 화학 요법 제의 췌관 배송은 이전의 증거와 매우 효과적인 것으로 표시되었습니다독성 또는 장기 조직 병리학 적 ^3-6을 변경합니다. 또한, 종양 세포 주입 및 암 유전자의 렌티 바이러스 벡터 배달 이전에 췌관 주입 ^7-10을 통해 가능한 것으로 표시되었습니다.

약물 전달뿐만 아니라,이 절차는 siRNA를 췌관 내 주입을 통해 유선 유전자의 지역 침묵에 유용합니다. siRNA의 솔루션의 작은 볼륨의 주입은 유선의 해부학과 생리학을 변경하지 않으면 효과가있다. 우리의 실험실에서 우리는 최근에 자발적으로 (브록 등., 게시되지 않은) 종양의 진행의 예방의 결과로 유방 종양을 개발하는 형질 전환 마우스의 주요 매개체 유전자의 성공적인 침묵을 보여 주었다. 우리는 눈에 보이는 조직의 손상 또는 독성 2 주 간격으로 7 번까지 같은 젖꼭지에 격주 주사를 반복 할 수있게되었습니다.

췌관 내 주사는 DEVEL를 해결하기 위해 성인 마우스를 초과 할 수임신, 수유 및 퇴화 동안이나 종양 발생과 진행 과정 이후 단계를 대상으로 유선 개발과 관련된 opmentally 특정 이벤트. 8 주령 한 젊은 처녀 암컷은 우리의 실험실에서 비 침습적으로 주입되었다.

Protocol

1. 주입 용액의 제조 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 관심의 다른 수용액에 0.2 % 에반스 블루 염료를 준비합니다. 이 중요한 염료 췌관 주사의 성공을 평가하는 데 유용합니다 및 기술에 대한 전문 지식을 개발할 때 시각화 원조로 추천합니다. 필요한 부피가 주입되는 동맥의 개수 및 위치에 의존 할 것이다. 암컷 생쥐의 10 유방 동맥 주입 할 수 있지만 인해 작은 선 (腺)의 크기로, 선 쌍 1과 5는 일반적으로 용액 10 μL로 주입된다. 다른 모든 유방 쌍은 20 μL로 주입된다. 이 볼륨은 전체 유관 트리를 채우기에 충분하다. 2. 수술 전 준비 각 마우스의 체중을 기록한다. 모든 임상 연구에서와 같이, 동물의 무게는 잠재적 인 독성을 평가하기 위해 (일주일에 두 번 이상) 정기적으로 모니터링해야한다. m를 마취이소 플루 란 챔버를 사용하여 여러개 눈 윤활제를 적용합니다. 절차를 수행하는 동안 마우스는 코 콘을 통해 산소 이소 플루 란의 흡입 2~4% 농도를 사용하여 마취 할 것입니다. 조심스럽게 따라 이소 플루 란의 수준을 조절, 호흡의 변화에​​ 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 피하 전에 진통제 등의 절차에 멜 록시 캄 (5 ~ 10 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 유두 영역에 이상 – 더 – 카운터 제모 크림을 적용합니다. 5 분을 기다린 후 부드럽게 원 운동을 사용하여,면 – 팁 어플리케이터 느슨한 머리를 제거합니다. 따뜻한 물에 젖은 축축한 종이 타월을 사용하여 크림을 제거합니다. 면도로 인해 유두를 손상의 위험을 권장하지 않습니다. 부드럽게 사지를 테이핑하여 입체경에서 마우스를 고정합니다. 알코올 면봉으로 닦아 주사 부위. 3. 췌관 내 주입 입체경 아래에 주입하는 적절한 젖꼭지를 찾습니다. 뽐내는 마이크로 해부 벌금을 사용하여젖꼭지 입구를 덮고 죽은 피부를 제거하는 zers. 부착 된 33 G 금속 허브 바늘로 50 μL 주사기에로드 주입 솔루션의 20 μL. 때때로, 주사 후, 소량 (1 μL 이하) 바늘을 잡아 당겨에 젖꼭지 밖으로 누출 수 있습니다. 따라서, 잠재적 인 손실을 고려하여 각각 11, 21 μl를 주입하는 것이 좋습니다. 미세 핀셋으로 가볍게 유두를 잡고 삽입을 위해 위치를 약간 들어 올립니다. 그것은 유두를 잘라 필요가 없습니다. 급속 유관 루멘 내에 유체를 이동으로 인한 잠재적 인 손상을 최소화하기 위해 천천히 용액을 주입한다. 사출 속도는 약 40 μL / 분으로 유지되어야한다. 4. 수술 후 관리 주사 부위를 관찰한다. 젖꼭지 지역 또는 주변 조직에 외상의 흔적이 없어야합니다. 유두 주변 지역의 붓기 가능성이 유방 지방 패드 주입 신속한를 나타냅니다성공적인 췌관 주사보다 연구. 코 콘에서 동물을 제거하고 복구를위한 별도의 케이지로 이동합니다. 저체온증을 방지하고 회복을 지원하기 위해 가열 램프 아래에 케이지를 놓습니다. 마우스는 단독으로 보관되어 그들은 의식과 이동성을 회복 할 때까지주의 깊게 감시한다. 5. 유선 조직의 분석 조사 종료 후, 마우스는 분리 챔버에서 CO 2 압축 가스는 다음의 경추 탈구하여 안락사된다. 젖샘은 절제하고 전체 마운트 제조 11, 조직학, 또는 RNA와 단백질의 분리를 위해 사용될 수있다.

Representative Results

젖꼭지는 쉽게 머리가 (그림 1A)를 둘러싼 지역에서 제거 된 후에 실체를 사용하여 지역화 할 수 있습니다. 사출 기술을 마스터하기 위해서는 에반스 청색 염료를 주입하고, 선 (腺)의 무결성 (그림 1B 및 C)를 모니터링하는 것이 좋습니다. 이 방법은 하나의 시각적 염료 전체 유관 시스템 (그림 1C 및 2A)에 도달 여부를 평가 할 수 있습니다 각 동맥에 주입 할 수있는 적절한 볼륨을 결정 할 수 있습니다. 주입 에반스 청색 화상의 화상은 전체 유관 트리 카민 명반 염료 (도 2B)로 염색되는 전체 장착 유방 선에 비교 될 수있다. 이 주입 방법의 견고성은 운영자에 크게 의존되어 있습니다. 예를 들어, 덕트를 관통하는 유방 지방 패드에 주입 발생하고 용액을 주입하는 것은 너무 빠르 유관 상피 CEL가 손상 될LS 및 염증 반응을 자극. 성공적인 췌관 주입은 유선으로 지역화 된 약물 전달을 가능하게하고, 그렇지 않으면 종종 관찰 비특이적 부작용을 줄일 수 있습니다. 찬란 주사 선 (腺)의 예제 이미지는 그림 3에서 볼 수 있습니다 cyclophilin (비 필수 유전자)를 대상으로 siRNA를 태그. 그림 1. 사타구니 유선 에반스 블루 염료로 유두를 통해 주입했다. 20 μL 에반스 블루 염료 주입 후 주입 및 B 전에 유두의) 외관). 제공된 팽윤 또는 조직 손상 피부를 열면. C)을 관찰하고, 염료는 전체 유방 유관 트리의 시각화를 허용한다. 그림 2. 에반스 블루의 분석을 전체 마운트투사 선. A) 동물로부터 적출 즉시 지방 후 카민 염료와 같은 선 (腺)의 주입. B) 전체 마운트 염색 후 유리 슬라이드에 확산 해부 선 (腺)의 대표 이미지가 삭제되었다. A)과의 비교는 주입 된 솔루션은 유방 유관 트리를 채우고 선 해부학 적 손상되지 않은 것을 확인합니다. 그림 3. 신선한 조직 샘플의 형광 siRNA를 췌관 배달. 대표 이미지는, 48 시간의 주 사후을 절제.

Discussion

형질 전환 및 녹아웃 마우스는 유방암의 개별 유전자의 생체 내 역할을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 그러나, 많은 비용과 시간이 소요되는 이러한 동물을 생성 할 수 있으며 유전자 녹다운 때때로 유선 해당 유전자의 특정 효과를 인식 저희 배제하는 통상 유비쿼터스이다. 따라서, 대상 최저 다른 장기에 비 특정 부작용과 독성의 문제를 완화하는 것이다.

여기에 소개 된 siRNA의 췌관 주입 마우스 유방 동맥의 지역화 된 유전자 최저 수 있습니다. 그것은 siRNA를 전달로 제한되지 유선에 대한 대상 및 지역화 된 약물 전달을위한 빠른 방법입니다. 이러한 유선 특정 약물 전달은 다른 장기에 불특정 부작용 및 독성을 방지하고 유선의 발달과 유방 종양을 형성하는 동안 특정 시간 지점에서 유전자 변화를 연구 할 수 있습니다. SI의 증거는 없다비 주입 땀샘에서 RNA 입자 간 또는이 방법이 유선에서 지역화 된 유전자 최저에 대한 선호하는 방법을 제공합니다 추가 증거를 제공하는 다른 기관. 또한, 췌관 주사 치료제 장기간 모니터링을 허용하도록 수개월 동안 매주 또는 격주로 반복 될 수있다.

이 기술은 마우스 유방 덕트 다양한 시약 췌관 대금 시금위한 가능성을 연다. 잘 특성화 마우스 모델에서 현지화 된 배달의 발전은 비 침습의 응용 프로그램을 가속한다, 인간의 치료 전략을 대상으로.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05