Стационарная, Pre-стационарная, и односпальная кровать-оборота кинетические измерения активности ДНК гликозилаза
Summary
Время курсы для гликозилазу деятельность 8-оксогуанин ДНК гликозилазу являются двухфазные выставке взрыв формирования продукта и линейной стационарной фазы. Использование охлаждение потока техники, взрыв и стационарное показатели могут быть измерены, что соответствует удалению 8-оксогуанин и выпуск гликозилаза от продукта ДНК соответственно.
Abstract
Человеком 8-оксогуанин ДНК-гликозилаза (OGG1) вырезает мутагенных окислительное повреждение ДНК 8-оксо-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) из ДНК. Кинетическая характеристика OGG1 проводится для измерения скорости 8-oxoG иссечение и выпуска продукции. Когда OGG1 концентрации ниже, чем субстратной ДНК, временной ход образование продукта являются двухфазные; быстрый экспоненциальной фазе (т.е. разрыв) образования продукта следует линейной стационарной фазы. Первоначальный выброс образования продукта соответствует концентрации фермента в зацепление на подложке, и взрыв амплитуда зависит от концентрации фермента. Первого порядка константа скорости взрыв соответствует истинный коэффициент 8-oxoG иссечение и медленнее стационарного скорости измеряет скорость выпуска продукта (продукт ДНК константы скорости диссоциации, K OFF). Здесь мы описываем стационарный, предварительно стационарных и одного оборота подходы для выделения и измерения зрecific шаги во OGG1 каталитического велоспорт. Меченных флуоресцентными поражение-содержащий олигонуклеотид и очищенный OGG1 используются для облегчения точного кинетических измерений. Так как низкие концентрации фермента используются для стационарных измерений, ручное перемешивание реагентов и гашение реакции может быть выполнен, чтобы установить стационарные скорости (к выключен). Кроме того, экстраполяция стационарных скоростью до точки на оси ординат в нулевой момент времени показывает, что взрыв образование продукта произошла во время первого оборота (т.е. у-перехват положительна). Первого порядка константа скорости экспоненциальной фазе всплеска может быть измерена с использованием быстрое смешивание и закалки метод, который проверяет объем продукта, полученного на короткие промежутки времени (<1 сек) до стационарной фазы и соответствует скорости 8 -oxoG иссечение (т.е. химии). Химические стадии, может также быть измерена с использованием одного оборота подход, при котором каталитический велосипедепредотвратить насыщение ДНК субстрата с ферментом (E> S). Эти подходы можно измерять элементарных констант скорости, которые влияют на эффективность удаления повреждений ДНК.
Introduction
Аэробной среде спешит геномной нестабильности. Основным promutagenic поражение ДНК в результате окислительного стресса 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxoG). Это связано с неоднозначным кодирования потенциал 8-oxoG. Человека 8-оксогуанин ДНК гликозилазу (OGG1) отвечает за разработку базы репарации 8-oxoG. Гликозилазу деятельности OGG1 акцизов 8-oxoG базы в результате ДНК-продукт с сайта апуриновыми (AP-сайта). Слабую активность лиазы OGG1 можно надрезать AP-сайта в некоторых случаях.
Кинетическая характеристика ДНК гликозилазами вообще считает, что они проявляют двухфазный курсах времени. После начальной фазы быстрого образования продукта (т.е. разрыв), линейный стационарной фазы наблюдается 1-3. Такое поведение является показателем шагом после химии (т.е. конформационных изменений или выпуска продукта), которые лимитирующей при линейной части хода времени, тогда как борй этап, часто упоминается как переходный этап, соответствует образование продукта в активном центре фермента в ходе первого цикла реакции. При выпуске продукта является ограничение скорости во время стационарной фазы, измерения активности обеспечивают качественную меру продукта ДНК-связывающим сродством, но не предоставляют информацию о кинетической событиях в активном центре фермента (например, химия). Таким образом, методы, чтобы изолировать и измерить экспоненциальное предварительно стационарного взрыва фазе необходимо, чтобы исследовать события в течение первых ферментативной оборот в активном 4 центре фермента.
Существуют три стандартных кинетические подходы для характеристики каталитического поведение OGG1 (1) стационарный, (2) предварительно стационарный, и (3) одного оборота. Эти подходы отличаются друг от друга на концентрацию фермента в реакционной смеси и фермента к субстрату соотношение используемой в каждом подходе. В типичной стационарный подходиногда называют несколько кинетика оборота, низкие концентрации фермента, используют для последующей образование продукта. Концентрации субстрата значительно превышает концентрацию фермента, так что несколько ферментативных обороты не оказывают существенного влияния концентрации субстрата. В этой ситуации время курсов должны быть линейными и часто бывает трудно определить, является ли взрыв произошел во время первого оборота из-за низкой концентрации фермента, используемого в данном подходе, обратите внимание, что взрыв амплитуды эквивалентно концентрации фермента. Эту проблему можно решить путем использования более высокой концентрации фермента и экстраполяции линейной курс времени нулевого времени для обнаружения ли первый ферментативный оборот произошло быстро. Отрезок на оси ординат (Y-ось) должна быть пропорциональна концентрации фермента и обеспечивает измерение фермент активно взаимодействует с подложкой. Хотя такой подход может, в принципе свидетельствуют о существовании взрыв фазе дифferent подход необходим для измерения кинетики взрыв фазы. Во многих случаях взрыв фаза слишком быстро, чтобы измерить ручного микширования и методы тушения. В этом случае предварительно стационарных и одного оборота кинетической (т.е. переходных кинетической) приближается часто требуется быстрое смешивание и закалки инструмента следовать ранние моменты времени реакции 5. В предварительно стационарный подход высокие концентрации фермента используются так, что значительное количество продукта образуется во время первого оборота. Поскольку несколько оборотов следуют наблюдать каталитического велосипедные (т.е. линейной фазой, которая следует за разрыв), концентраци субстрата составл ет больше, чем концентрация фермента ([фермент] <[субстрата]). Для выделения событий в активном центре фермента без каталитического езда на велосипеде, одного оборота условиях были использованы. В этом случае подложка пропитана фермента (E >> S) так, чтобы все подложки будет участвовать яN 'одного оборота и, как правило, проявляют одноэкспоненциальный время курса.
Как отмечалось выше, для ферментов, которые демонстрируют взрыв фазе, выпуск продукции (к выключен) часто ограничивает скорость стационарной фазы хода времени. Скорость выпуска продукта (V SS, конц. / Время) может быть определена из наклона линейной стационарной фазы. Концентрация активного фермента (Е), необходимых для преобразования скорости выпуска продукта на внутренние константы скорости где к OFF = V SS / [E]. Важно отметить, что концентрация активного фермента обычно ниже, чем измеренные концентрации белка из-за примесей, неактивный фермент, фермент, не продуктивно связаны с подложкой, и метод, используемый для определения концентрации белка. Концентрация активного фермента может быть определена из пакета, когда амплитуда выпуска продукта идет медленно. Таким образом, экстраполяция стационарных время курсанулевое время дает оценку активного фермента, необходимое для расчета K OFF (выпуска продукции) от наблюдаемых стационарных ставке.
Для измерения кинетики взрыв, предварительно стационарный подход необходимо следовать образование продукта в течение первого оборота, что происходит до линейной стационарной фазы. Взрыв кинетики следует формирование фермента промежуточным продуктом. После Реакцию инициировали путем смешивания фермента с субстратом, количество фермента, продукт резко возрастает, пока реакция не достигает устойчивого фазового состояния. Если катализ происходит намного быстрее, чем выпуск продукта, амплитуда всплеска равна активно участвует фермент и наблюдаемое экспоненциальное приближение к равновесию (к набл) соответствует скорости химическое превращение субстрата в продукт, при условии, что обратная скорость химии является незначительным.
В некоторых случаях каталитического суцепляются мешает предварительного стационарного анализа, такие как, когда величины ставки по химии и выпуска продукции существенно не отличаются. В этом случае, используя относительный избыток фермента к субстрату предотвращает каталитического на велосипеде и пределы подложки связанный с ферментом в один оборот. Таким образом, первый этап химической реакции может быть выделен и точно определены в качестве первого порядка константы скорости (к набл). Это константа скорости должна быть похожа на K набл определяется из предварительного стационарного подхода, описанного выше.
Здесь мы описываем, как эти кинетические подходы могут быть использованы для анализа гликозилаза активность OGG1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кинетическая описанные здесь подходы наметить методы определения элементарных кинетических констант. Если временной ход образование продукта является двухфазным с первой ферментативной оборот, происходящие быстро, то шаг после химии является лимитирующей при последующем каталити?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Джули К. Хортон за критическое прочтение рукописи и д-р Раджендра Прасад за полезные советы и обсуждения. Части этого исследования были первоначально опубликованы в журнале Biological Chemistry, Sassa ET. др.., "Контекст Последовательности ДНК Воздействие на гликозилаза активности человека 8-оксогуанин гликозилаза ДНК." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Эта работа была поддержана, полностью или частично, Национального института исследований в области здравоохранения грантового проекта Z01-ES050158 в очной программе исследований, NIEHS.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
