DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm
Summary
8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.
Abstract
İnsan 8-oxoguanine DNA glikosilaz (OGG1) DNA mutajenik oksidatif DNA lezyon 8-okso-7 ,8-dihidroguanin (8-oxoG) excises. OGG1 kinetik karakterizasyonu 8-oxoG eksizyon ve ürün sürümü oranları ölçmek için yapılmaktadır. OGG1 konsantrasyonu yüzey DNA daha az olması durumunda, ürün oluşum zamanlı kurslar bifaziktir, ürün oluşumunun hızlı bir üstel faz (yani patlama) doğrusal kararlı durum faz takip eder. Ürün oluşumunun ilk patlama alt tabaka üzerinde düzgün bir şekilde yapan enzim konsantrasyonu karşılık gelir ve patlama genlik enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Patlama sürekli birinci dereceden 8-oxoG eksizyon içsel oranı karşılık gelir ve yavaş kararlı durum oranı ürün sürümü (sürekli ürün DNA ayrışma oranı, k kapalı) oranını ölçer. Burada, kararlı durum, öncesi kararlı durum ve tek cirosu yaklaşımlar sp izole etmek ve ölçmek için tarifOGG1 katalitik devir esnasında ecific adımları. Bir floresan etiketli lezyon içeren bir oligonükleotit ve saflaştırılmış OGG1 hassas Kinetik ölçümleri kolaylaştırmak için kullanılır. Düşük enzim konsantrasyonları kararlı durum ölçümleri, reaksiyon reaktiflerin karıştırma manuel ve soğutma yapmak için kullanılan bu yana kararlı durum oranı (k off) tespit etmek için yapılabilir. Ayrıca, sıfır zamanda ordinat üzerinde bir noktaya kararlı durum oranı ekstrapolasyon ürün oluşumu bir patlama ilk sermaye (yani y-kesişim pozitif) sırasında oluştuğunu gösterir. Üslü kayma fazı sürekli birinci dereceden kararlı durum faz önce kısa zaman aralıklarında (<1 saniye) de elde edilen ürünün miktarını inceler ve 8 hızına karşılık gelen bir hızlı karıştırma ve soğutma tekniği kullanılarak ölçülebilir -oxoG eksizyon (yani kimya). Katalitik bisiklet olduğu kimyasal adım, aynı zamanda, bir tek ciro yaklaşım kullanılarak ölçülebilirenzim (E> S) ile doyurarak substrat DNA ile önlenebilir. Bu yaklaşımlar bir DNA lezyonun çıkarılması verimliliğini etkileyen temel hız sabitleri ölçebilirsiniz.
Introduction
Aerobik ortam genomik istikrarsızlık hızlandırır. Oksidatif stresten kaynaklanan önemli bir promutagenic DNA lezyon 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-oxoG) 'dir. Bu 8-oxoG en belirsiz kodlama potansiyelinin kaynaklanmaktadır. İnsan 8-oxoguanine DNA glikozilaz (OGG1) 8-oxoG baz eksizyon onarımı başlatmak için sorumludur. OGG1 glikozilaz aktivitesi apurinic sitesi (AP-sitesi) ile ürün DNA ile sonuçlanan 8-oxoG tabanı özel tüketim vergilerine. OGG1 Zayıf bir liyaz aktivite bazı durumlarda AP-sitesi insizyon olabilir.
DNA glikolazdan kinetik karakterizasyonu genelde bifazik zamanlı kurslar sergi bulur. Ürün oluşumu bir ilk hızlı faz (yani patlama) sonra, doğrusal kararlı durum faz 1-3 görülmektedir. Bu davranış, bur ise, kimya (yani yapısal bir değişiklik veya ürün ayırma) arasında, zaman akışının lineer kısmı boyunca oran-sınırlayıcı olma aşağıdaki bir aşama göstergesidirgenellikle geçiş fazı olarak adlandırılan faz st, birinci reaksiyon döngüsü sırasında, enzim aktif bölgesinde ürün oluşumuna tekabül eder. Ürün sürümü kararlı durum aşamasında sınırlama oranı olduğunda, aktivite ölçümleri ürün DNA bağlanma afinitesi niteliksel bir ölçü sağlar, ancak enzim aktif bölge (yani kimya) de olaylarla ilgili kinetik bilgi vermemektedir. Buna göre, üstel öncesi kararlı durum patlama faz izole etmek ve ölçmek için yöntemler enzimin aktif bölge 4 ilk enzimatik devir sırasında olayları araştırmak için gereklidir.
(1) kararlı durum, (2) öncesi kararlı durum ve (3) tek cirosu OGG1 katalitik davranışını karakterize etmek için üç standart kinetik yaklaşım vardır. Bu yaklaşımlar, reaksiyon karışımı içinde enzim konsantrasyonu ve her bir yaklaşımda kullanılan substrat oranı için enzim tarafından birbirinden farklıdır. Tipik bir kararlı durum yaklaşımda,bazen birden devir kinetik olarak adlandırılan, enzimin düşük konsantrasyonlarda ürün formasyonu takip etmek için kullanılır. Birden fazla enzimatik kaybı önemli alt tabaka konsantrasyonu etkilemez böylece substrat konsantrasyonu büyük ölçüde Enzim konsantrasyonu aşmaktadır. Bu durumda, zaman içerisinde doğrusal olmalıdır ve bir patlama bu yaklaşımda kullanılan düşük enzim konsantrasyonu nedeniyle ilk devir sırasında meydana gelen olmadığını ayırt etmek zordur; not genlik kayma Enzim konsantrasyonu eşdeğer olduğunu. Bu daha yüksek bir enzim konsantrasyonu kullanılarak ve ilk enzimatik cirosu hızla oluştu olup olmadığını tespit etmek için sıfır zaman doğrusal zaman ders extrapolating aşılabilir. Ordinat üzerinde kesişim noktası (y-ekseni), enzim konsantrasyonu ile orantılı olması ve aktif alt-tabaka ile enzimin yapan bir ölçüsünü sağlar gerekir. Bu yaklaşım, ilke olarak, bir kayma fazı varlığı için kanıt, dif sağlayabilir rağmenlara yaklaşım kayma fazı kinetiğini ölçmek için gereklidir. Birçok durumda patlama aşamasında el karıştırma ve soğutma teknikleri ile ölçmek için çok hızlı. Bu durumda, ön-kararlı durum ve tek cirosu kinetik (yani geçici kinetik) genellikle reaksiyon 5 erken zaman noktalarında takip etmek bir hızlı karıştırma ve soğutma cihazı gerektirir yaklaşır. Bir ön-kararlı durum yaklaşımda enzimin yüksek konsantrasyonlarda ürünün önemli bir miktarı, ilk devir sırasında oluşacak şekilde kullanılır. Birden fazla cirolar katalitik bisiklet (yani patlama aşağıdaki doğrusal faz) gözlemlemek için takip olduğundan, substrat konsantrasyonu enzim konsantrasyonu ([enzim] <[yüzey]) daha büyüktür. Katalitik binme olmadan, enzimin aktif bölgesinde olayları izole etmek için, tek devir koşulları kullanılmaktadır. Bu durumda, alt-tabaka alt-tabakanın tüm i katılacak şekilde (E >> S) enzimi ile doymuşn 'tek cirosu' ve genellikle tek üstel zaman tabii sergileyecek.
Bir kayma fazı, ürün serbest (k off) sergileyen enzimler için yukarıda belirtildiği gibi çoğu zaman akışının kararlı durum faz hızını sınırlar. Ürün sürümü (v ss, kons. / Saat) oranı doğrusal kararlı durum faz eğimi tespit edilebilir. Aktif enzim konsantrasyonu (E) sabit bir iç Oranı ürün sürümü oranını dönüştürmek için gerekli olduğu k off = v ss / [E]. En önemlisi, aktif enzim konsantrasyonu kirleri nedeniyle ölçülen protein konsantrasyonu, etkin enzim, enzim olmayan üretken bir substrata bağlı ve protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılan yöntem, genellikle daha düşüktür. Ürün serbest yavaş olduğunda, aktif enzim konsantrasyonu patlama genlik belirlenebilir. Böylece, bir kararlı durum zaman tabii extrapolatingsıfır zaman gözlenen kararlı durum oranı k off (ürün sürümü) hesaplamak için gerekli aktif enzim bir tahmin sağlar.
Kaymasının kinetiği ölçmek için, bir ön-kararlı durum yaklaşım doğrusal kararlı-durum faz önce meydana gelen ilk devir esnasında ürün oluşumunu takip etmek gereklidir. Patlama kinetik enzim ara ürünün oluşumu izler. Reaksiyon alt-tabaka ile enzimin karıştırma başlatılır Reaksiyon tamamlandıktan sonra sabit bir durum faz ulaşana kadar, enzim-ürününün miktarı hızla artmaktadır. Kataliz çok daha hızlı bir ürün serbest fazla ise, kayma genliği varsayarak, ürün substratm kimyasal dönüştürme hızına karşılık gelen denge aktif yapan enzim ve gözlemlenen üslü yaklaşım (k OBS) eşit olan bir tam tersi oranı kimya ihmal edilebilir düzeydedir.
Bazı durumlarda katalitik cysarılmak gibi kimya ve ürün sürümü için oranları büyüklükleri önemli ölçüde farklı değil olduğu gibi bir ön-kararlı durum analizi, müdahale. Bu durumda, yüzeye aşırı enzim göre istihdam tek bir ciroya enzim ile bağlı katalitik bisiklet ve sınırları yüzey önler. Birinci derece hız sabiti (K OBS) Buna göre, birinci reaksiyon kimyasal adım izole edilebilir ve daha doğru bir şekilde tespit edilmiştir. Bu oran sabit bir atıl k benzer yukarıda tarif edilen ön kararlı hal yaklaşımdan belirlenmelidir.
Burada bu kinetik yaklaşımlar OGG1 glikozilaz etkinliği analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kinetik yaklaşımlar temel kinetik sabitleri tanımlamak için yöntemler ana hatlarıyla burada açıklanan. Ürün oluşumu, bir zaman süreci ilk enzimatik devir hızla meydana gelen iki fazlı ise, kimya sonra bir adım daha sonra katalitik devirleri sırasında oran-sınırlayıcı. OGG1 durumunda, birinci devir ya da (S <E) veya (S> e yüksek) DNA konsantrasyonları sınırlayıcı yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak ölçülebilir. İlk durumda, reaksiyon, bir 'tek-ciro' sınırlıdır ve en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı öneriler ve tartışmalar için el yazması ve Dr Rajendra Prasad eleştirel okuma Dr Julie K. Horton teşekkür ederim. Bu araştırmanın bazı bölümleri ilk Biyolojik Kimya, Sassa A et Dergisi yayımlandı. al., "İnsan 8-Oxoguanine DNA glikosilaz en glikosilaz Aktivitesi Üzerine DNA Dizi Bağlam Etkileri." Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı Sağlık Araştırma Projeleri Z01-ES050158 Ulusal Enstitüleri, NIEHS tarafından, tamamen veya kısmen, desteklenmiştir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
