DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Summary

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

Abstract

İnsan 8-oxoguanine DNA glikosilaz (OGG1) DNA mutajenik oksidatif DNA lezyon 8-okso-7 ,8-dihidroguanin (8-oxoG) excises. OGG1 kinetik karakterizasyonu 8-oxoG eksizyon ve ürün sürümü oranları ölçmek için yapılmaktadır. OGG1 konsantrasyonu yüzey DNA daha az olması durumunda, ürün oluşum zamanlı kurslar bifaziktir, ürün oluşumunun hızlı bir üstel faz (yani patlama) doğrusal kararlı durum faz takip eder. Ürün oluşumunun ilk patlama alt tabaka üzerinde düzgün bir şekilde yapan enzim konsantrasyonu karşılık gelir ve patlama genlik enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Patlama sürekli birinci dereceden 8-oxoG eksizyon içsel oranı karşılık gelir ve yavaş kararlı durum oranı ürün sürümü (sürekli ürün DNA ayrışma oranı, k _kapalı) oranını ölçer. Burada, kararlı durum, öncesi kararlı durum ve tek cirosu yaklaşımlar sp izole etmek ve ölçmek için tarifOGG1 katalitik devir esnasında ecific adımları. Bir floresan etiketli lezyon içeren bir oligonükleotit ve saflaştırılmış OGG1 hassas Kinetik ölçümleri kolaylaştırmak için kullanılır. Düşük enzim konsantrasyonları kararlı durum ölçümleri, reaksiyon reaktiflerin karıştırma manuel ve soğutma yapmak için kullanılan bu yana kararlı durum oranı (k _off) tespit etmek için yapılabilir. Ayrıca, sıfır zamanda ordinat üzerinde bir noktaya kararlı durum oranı ekstrapolasyon ürün oluşumu bir patlama ilk sermaye (yani y-kesişim pozitif) sırasında oluştuğunu gösterir. Üslü kayma fazı sürekli birinci dereceden kararlı durum faz önce kısa zaman aralıklarında (<1 saniye) de elde edilen ürünün miktarını inceler ve 8 hızına karşılık gelen bir hızlı karıştırma ve soğutma tekniği kullanılarak ölçülebilir -oxoG eksizyon (yani kimya). Katalitik bisiklet olduğu kimyasal adım, aynı zamanda, bir tek ciro yaklaşım kullanılarak ölçülebilirenzim (E> S) ile doyurarak substrat DNA ile önlenebilir. Bu yaklaşımlar bir DNA lezyonun çıkarılması verimliliğini etkileyen temel hız sabitleri ölçebilirsiniz.

Introduction

Aerobik ortam genomik istikrarsızlık hızlandırır. Oksidatif stresten kaynaklanan önemli bir promutagenic DNA lezyon 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-oxoG) 'dir. Bu 8-oxoG en belirsiz kodlama potansiyelinin kaynaklanmaktadır. İnsan 8-oxoguanine DNA glikozilaz (OGG1) 8-oxoG baz eksizyon onarımı başlatmak için sorumludur. OGG1 glikozilaz aktivitesi apurinic sitesi (AP-sitesi) ile ürün DNA ile sonuçlanan 8-oxoG tabanı özel tüketim vergilerine. OGG1 Zayıf bir liyaz aktivite bazı durumlarda AP-sitesi insizyon olabilir.

DNA glikolazdan kinetik karakterizasyonu genelde bifazik zamanlı kurslar sergi bulur. Ürün oluşumu bir ilk hızlı faz (yani

Protocol

1. Enzim ve DNA Yüzey hazırlanması

1. E. bir GST-füzyon proteini olarak aşırı ifade OGG1 coli, saflaştırma için GST-tag, uygulanması ve daha sonra, HRV-3C proteaz (Şekil 1) ⁶ ile bölünme ile GST-tag çıkarın.
2. Tek 8-oxoG kalıntı içeren kimyasal olarak sentezlenmiş 5'-6-carboxyfluorescein (6-FAM) etiketli oligonükleotid ve tamamlayıcı etiketsiz oligonükleotid iplikçik satın alın. 34-mer oligonükleotid 5'-ucundan 17 pozisyonunda bir 8-oxoG içerir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile, bu oligonükleotitler arındırın.
3. Tavlama tamponu 1:1.2 arasında bir mol oranında (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI,....

Results

Kararlı durum kinetik analizi, bir Bradford protein deneyi ² ile belirlenen 200 nM DNA alt tabaka ve OGG1 dört farklı görünen konsantrasyonları (15, 30, 45 ve 60 nM) kullanılarak gerçekleştirildi. Ürün oluşumu süresi içerisinde 2.2 idi y kesişim noktası, 11, 15, ve her bir protein konsantrasyonuna (Şekil 2B) göre, sırasıyla 26 nM, belirlemek için bir doğrusal eşitliğe oturtuldu. Y yakaladığını ayrıca, her biri gerçek protein konsantrasyonu (Şekil 2C) göre grafiği çizilmiştir........

Discussion

Kinetik yaklaşımlar temel kinetik sabitleri tanımlamak için yöntemler ana hatlarıyla burada açıklanan. Ürün oluşumu, bir zaman süreci ilk enzimatik devir hızla meydana gelen iki fazlı ise, kimya sonra bir adım daha sonra katalitik devirleri sırasında oran-sınırlayıcı. OGG1 durumunda, birinci devir ya da (S e yüksek) DNA konsantrasyonları sınırlayıcı yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak ölçülebilir. İlk durumda, reaksiyon, bir 'tek-ciro' sınırlıdır ve enzimin aktif bölgesinde katalitik oran.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
5'-6-FAM etiketli oligonükleotidler, tek bir 8-oksoG	Eurofins MWG Operon		5'-P32 radyoaktif işaretli oligonükleotidler de kullanılabilir. Poliakrilamid jel saflaştırma derecesi önerilir.
Etiketlenmemiş oligonükleotidler (tamamlayıcı iplikçik)	Eurofins MWG Operon		Poliakrilamid jel saflaştırma derecesi önerilir.
1 ml BD Luer Lock tek kullanımlık şırınga	BD Medical	309628	Lue Lock diğer satıcılardan tek kullanımlık şırınga da kullanılabilir.
10 ml BD Luer Lock tek kullanımlık şırınga	BE Medical	309604	Luer Lock diğer satıcılardan tek kullanımlık şırınga da kullanılabilir.
Equipment
Sirkülasyonlu su banyosu	herhangi bir satıcı
RQF-3 Hızlı Söndürme Akış Aleti	KinTek Corporation		Hızlı Söndürme Akışı Aleti de kullanılabilir.
Typhoon Phosphorimager 8600	GE Healthcare Yaşam Bilimleri		Görüntüleyici diğer satıcılardan da kullanılabilir.
KaleidaGraph	Sinerji Yazılımı