Steady-state, Pre-steady-state, och Single-omsättningen Kinetic Mätning för DNA-glykosylas aktivitet
Summary
Tidsförlopp för glykosylaset aktiviteten av 8-oxoguanin DNA glykosylas är bifasisk uppvisar en explosion av produkten bildas och en linjär steady-state fasen. Använda släcka-flöde tekniker, det brast och steady-state priser kan mätas, vilket motsvarar excision av 8-oxoguanin och frisättning av glykosylaset från produkt-DNA, respektive.
Abstract
Humant 8-oxoguanin DNA-glykosylas (OGG1) skär ut den mutagena oxidativa DNA lesion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) från DNA. Kinetisk karakterisering av OGG1 görs för att mäta andelen 8-oxoG excision och produktlansering. När OGG1 koncentrationen är lägre än substrat-DNA, tidsförlopp för produktbildning är bifasisk, en snabb exponentiell fas (dvs. burst) av produktbildning följs av en linjär steady-state fas. Den initiala utbrottet av produktbildning motsvarar koncentrationen av enzym korrekt ingrepp på substratet, och den spruckna amplitud beror på koncentrationen av enzym. Den första ordningens hastighetskonstant av skuren motsvarar den inneboende frekvensen av 8-oxoG excision och den långsammare steady state hastighet mäter omfattningen av den produkt frisättning (produkt-DNA dissociationshastighet konstant koff). Här beskriver vi steady-state, pre-steady-state, och singel-omsättningen metoder för att isolera och mäta specific steg under OGG1 katalytisk cykling. En fluorescerande märkt lesion-innehållande oligonukleotid och renade OGG1 används för att underlätta exakta kinetiska mätningar. Eftersom låga enzymkoncentrationer används för att göra steady-state mätningar, manuell blandning av reagensen och släckning av reaktionen kan utföras för att fastställa den steady-state hastighet (koff). Dessutom indikerar extrapolering av steady-state-hastigheten till en punkt på ordinatan vid tiden noll som en skur av produktbildning skedde under det första omsättning (dvs. y-avskärning är positiva). Den första ordningens hastighetskonstant av den exponentiella brast fasen kan mätas med hjälp av en snabb blandning och härdning teknik som undersöker mängden produkt som bildas vid korta tidsintervall (<1 sek) innan steady-state fasen och motsvarar graden av 8 -oxoG excision (dvs. kemi). Den kemiska steget kan också mätas med hjälp av en enda omsättning strategi där katalytisk cykel ärförhindras genom att mätta substrat-DNA med enzym (E> S). Dessa metoder kan mäta elementära hastighetskonstanter som påverkar effektiviteten av avlägsnande av en DNA-skada.
Introduction
En aerob miljö skyndar genomisk instabilitet. En stor promutagenic DNA som orsakats av oxidativ stress är 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG). Detta är beroende på den oklara kodande potentialen hos 8-oxoG. Human 8-oxoguanin DNA glykosylas (OGG1) är ansvarig för att initiera reparation base excision av 8-oxoG. Glykosylaset aktivitet OGG1 klipper ut 8-oxoG bas resulterar i produkt-DNA med en apurinic webbplats (AP-site). En svag lyasaktivitet av OGG1 kan incisionsfilm AP-platsen i vissa fall.
Kinetisk karakterisering av DNA glykosylaser konstaterar generellt att de uppvisar bifasiska tidsförlopp. Efter en inledande snabb fas av produktbildning (dvs. burst) används en linjär steady-state fas observerades 1-3. Detta beteende är indikativt för ett steg som följer kemi (dvs. konformationsändring eller produkt frisättning) är hastighetsbegränsande under den linjära delen av tidsförloppet, medan borrenst fas, ofta kallad övergående fas, motsvarar produktens formation på enzymet aktiva under den första cykeln av reaktionen. När produktlansering är hastighetsbegränsande vid steady-state fas, aktivitet mätningar ger ett kvalitativt mått på produktens DNA-bindande affinitet, men ger inte kinetisk information om händelser på enzymet aktiva (dvs. kemi). Följaktligen är metoder för att isolera och mäta den exponentiella pre-steady-state burst fas behövs för att sondera händelser under första enzymatiska omsättning på enzymets aktiva säte 4.
Det finns tre vanliga kinetiska metoder för att karakterisera den katalytiska beteende OGG1, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, och (3) singel-omsättningen. Dessa metoder skiljer sig från varandra med koncentrationen av enzymet i reaktionsblandningen och enzymet till substrat-förhållande användas i varje metod. I en typisk steady-state tillvägagångssätt,ibland kallad flera omsättning kinetik, är låga koncentrationer av enzym som används för att följa produktbildning. Substratet koncentrationen överstiger kraftigt enzymkoncentrationen så att flera enzymatiska omsättningar inte signifikant påverkar substratkoncentration. I denna situation bör tidsförlopp vara linjär och det är ofta svårt att urskilja om en skur skedde under det första omsättning på grund av den låga enzymkoncentrationen som används i denna strategi, observera att brista amplitud är ekvivalent med enzymkoncentrationen. Detta kan lösas genom att använda en högre enzymkoncentration och extrapolera den linjära tidsförloppet till noll tid att upptäcka om den första enzymatiska omsättningen skedde snabbt. Skärningen på ordinatan (y-axel) bör vara proportionell mot enzymets koncentration och tillhandahåller ett mått av enzymet aktivt ingrepp med substratet. Även om detta tillvägagångssätt kan i princip ge bevis för existensen av en skur fas, en annan strategi krävs för att mäta kinetiken för burst fas. I många fall den spruckna fasen är för snabb för att mäta genom manuell blandning och härdning tekniker. I denna situation, närmar pre-steady-state och singel-omsättningen kinetisk (dvs. övergående kinetiska) kräver ofta en snabb-blandning och härdning instrument för att följa tidiga tidpunkter i en reaktion 5. I en pre-steady-state tillvägagångssätt höga koncentrationer av enzym används så att en betydande mängd av produkt bildas under den första omsättningen. Eftersom flera omsättningar följs att observera katalytisk cykling (dvs. den linjära fasen som följer burst), är substrat koncentration större än enzymet koncentrationen ([enzym] <[substrat]). Att isolera händelser vid det aktiva stället för enzymet utan katalytisk cykling, är singel-omsättningen förhållanden utnyttjas. I detta fall är substratet mättad med enzym (E >> S), så att alla av substratet kommer att delta in 'enda omsättning "och uppvisar typiskt en enda exponentiell tid kurs.
Som noterats ovan för enzymer som uppvisar en skur fas, produkt release (koff) ofta begränsar hastigheten av steady-state-fas av tidsförloppet. Hastigheten för produkt frisättning (v ss, konc. / Tid) kan bestämmas från lutningen av den linjära steady state fas. Den aktiva Enzymkoncentrationen (E) behövs för att omvandla hastigheten av produktens övergång till en inneboende hastighetskonstant där k off = v ss / [E]. Huvudsakligen är det aktiva enzymet koncentrationen vanligtvis lägre än den uppmätta protein koncentrationen på grund av föroreningar, inaktivt enzym, enzym icke-produktivt bundet till underlaget, och den metod som används för att bestämma protein koncentration. Den aktiva enzymet koncentrationen kan bestämmas från brast amplituden när produktlansering är långsam. Således extrapolera en steady-state tidsförloppet tilltiden noll ger en uppskattning av aktivt enzym behövs för att beräkna k off (produkt frisättning) från det observerade steady-state hastigheten.
För att mäta kinetiken hos skuren, är en pre-steady state strategi som är nödvändig för att följa produktbildning under första omsättning som inträffar före den linjära steady state fas. Skuren kinetik följer bildandet av enzym-produkt intermediär. När reaktionen initieras genom att blanda enzymet med substratet, ökar mängden av enzymet-produkten snabbt tills reaktionen når ett stabilt tillstånd fas. Om katalys är mycket snabbare än produktlansering, är amplituden av skuren lika aktivt enzym och den observerade exponentiell förhållningssätt till jämvikt (k obs) motsvarar graden av kemisk omvandling av substrat till produkt, förutsatt att den omvända graden av kemi är försumbar.
I vissa instanser katalytisk cyklamra stör en pre-steady-state analys, såsom när storlekarna på priserna för kemi och produktlansering är inte signifikant. I detta fall, med användning av överskott av enzym i förhållande till substrat förhindrar katalytisk cykling och gränser substrat bunden med enzym vid omsättningen. Följaktligen kan den första kemiska steget av reaktionen isoleras och noggrant bestämmas som den första-ordningens hastighetskonstant (k obs). Denna Hastighetskonstanten bör likna k obs bestämdes från pre-steady-state som beskrivs ovan.
Här beskriver vi hur dessa kinetiska metoder kan användas för att analysera glykosylaset aktivitet OGG1.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kinetiska metoder som beskrivs här beskriva metoder för att definiera elementära kinetiska konstanter. Om ett tidsförlopp för produktbildning är bifasisk och den första enzymatiska omsättning inträffar snabbt, då ett steg efter kemi är hastighetsbegränsande under efterföljande katalytiska omsättningar. I fallet med OGG1 kan den första omsättningen mätas med användning av höga enzymkoncentrationer med antingen begränsande (S <E) eller hög (S> E) DNA-koncentrationer. I det första fallet, rea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Julie K. Horton för kritisk läsning av manuskriptet och Dr Rajendra Prasad för användbara förslag och diskussioner. Delar av denna forskning publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "DNA-sekvens Context Effekter på glykosylas aktiviteten hos humana 8-oxoguanin DNA-glykosylas." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Detta arbete stöddes, helt eller delvis, av National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i Interna forskningsprogram, NIEHS.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
