العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة
Summary
الأنسجة الدهنية (AT) هو موقع على مكثفة تنشيط الخلايا المناعية والتفاعل. تقريبا جميع خلايا الجهاز المناعي موجودة في AT ويتم تغيير النسب من خلال السمنة. العزلة المناسبة، القياس الكمي، وتوصيف AT السكان الخلايا المناعية تعتبر بالغة الأهمية لفهم دورها في مرض immunometabolic.
Abstract
وقد أدى اكتشاف تسلل زيادة البلاعم في الأنسجة الدهنية (AT) من القوارض والبشر يعانون من السمنة المفرطة إلى تكثيف الاهتمام مساهمة الخلايا المناعية لمقاومة الانسولين وجهازية. العزلة والكمي لمختلف السكان الخلايا المناعية في العجاف والسمنة AT الآن تقنية تستخدم عادة في المختبرات immunometabolism، ويجب توخي الحذر الشديد حتى الآن سواء في انسجة الخلايا الوعائية والعزلة في تحليل التدفق الخلوي بحيث البيانات التي تم الحصول عليها هو موثوق بها والتأويل . في هذا الفيديو نحن لشرح كيفية اللحم المفروم، هضم، وعزل الخلايا المناعية التخصيب انسجة جزء الأوعية الدموية. وفي وقت لاحق، وتبين لنا كيفية الضامة تسمية الأجسام المضادة والخلايا الليمفاوية T وكيفية البوابة بشكل صحيح عليها في تجارب التدفق الخلوي. يتم توفير تدفق ممثل المؤامرات الخلوي من الدهون التي تغذيها الهزيل وارتفاع الدهون في الفئران السمينة التي تغذيها منخفضة. وثمة عنصر حاسم من هذا التحليل هو استخدام الأجسام المضادة التي تفعللا يتألق في القنوات حيث في الضامة هي autofluorescent بشكل طبيعي، فضلا عن استخدام ضوابط التعويض المناسب.
Introduction
تاريخيا، كان ينظر إلى الأنسجة الدهنية (AT) كجهاز تخزين خاملة من الدهون، والذي يوسع والعقود ردا على توازن الطاقة. ونحن نفهم الآن أن AT يمثل جهازا الغدد الصماء التي تفرز ديناميكية بنشاط عدد من الهرمونات التي تؤثر تأثيرا مباشرا سلوك التغذية والنظامية توازن الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، على مدى العقد الماضي كان هناك تقدير متزايد لسكان العديد من الخلايا المناعية المقيمين في AT جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص)، فضلا عن مساهمتها في AT التوازن.
القدرة على فصل AT خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص باستخدام هضم كولاجيناز تليها الطرد المركزي المغاير وقد وصفت لأول مرة في عام 1964 رودبيل 1. غالبا ما يتم استخدام كولاجيناز الثاني للفصل خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص بسبب الصيانة من مستقبلات الانسولين خلية شحمية 1. في وقت مبكر، وتجزيء الأنزيمية من AT كان يعمل في المقام الأول لدراسة الشحمcyte الأيض وعزل preadipocytes. وفي الآونة الأخيرة، وهذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع توافر نطاق واسع من أجهزة قياس التدفق الخلوي وعدد متزايد من المتاحة تجاريا الأجسام المضادة fluorophore مترافق، يسرت توصيف AT الخلايا المناعية.
على الرغم من وجود الخلايا المناعية في التهاب AT وقد وصفت سابقا 2، وأوراق المنوية بواسطة يسبيرج وآخرون. وشو وآخرون. نشرت في عام 2003 كانت أول لتوثيق تراكم AT الضامة (الصراف الآلي) في السمنة، والتي تفرز السيتوكينات الالتهابية وترتبط مع المقاومة AT-محددة والنظامية الأنسولين 3،4. خدم هذه الملاحظات كأساس لحقل جديد من التحقيقات التي صيغت مؤخرا، "immunometabolism،" 5 و تم متابعتها من قبل دراسات تورط مختلف السكان الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية 6، 7 الخلايا البدينة، الخلايا T 8 –10، خلايا B 11، خلايا NKT 12، 13 الحمضات، والعدلات 14،15 في تطوير البدانة ترتبط مقاومة الأنسولين.
الهدف من هذه المقالة هو أن تقدم وصفا مفصلا لتقنية هضم كولاجيناز تستخدم لعزل خلايا AT صندوق التبرعات الخاص لتوصيف وأجهزة الصراف الآلي وAT خلايا T عن طريق التدفق الخلوي. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس AT، ومع ذلك، يمكن أن تستفيد من المشاهدين قراءة مقال ممتاز تقديم تفاصيل مستفيضة حول الاستفادة المثلى من هذه التقنية للإنسان في 16. الجمهور المستهدف من هذه المادة يتضمن محققين من ذوي الخبرة المحدودة والعاملة مع الماوس AT وأداء التدفق الخلوي. وتعرض العديد من الاعتبارات العملية لتحقيق التوازن بين العائد الخلوية وقدرتها على البقاء مع الوقت والموارد، فضلا عن الضوابط المثلى التدفق الخلوي لوصف AT السكان الخلايا المناعية. بالإضافة إلى بروتوكول لدينا، والقراء هي referrإد إلى المادة إن الرب مؤخرا من قبل باسو وآخرون. لمناقشة ممتازة لبعض الجوانب الفنية من التدفق الخلوي لتشمل الضوابط المناسبة والتعويضات 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدى الاهتمام المتزايد في دور الجهاز المناعي في العواقب الأيضية من السمنة إلى الاستخدام الواسع النطاق للالتدفق الخلوي لتحديد خصائص الخلايا المناعية من AT. على الرغم من أن بروتوكول الدقيقة تختلف بين المختبرات على أساس الخبرة الخاصة بهم والمعدات المتاحة، وتشمل الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة JSO روث L. كيرشتاين NRSA (F32 DK091040)، معتمد من قبل AK زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية السكري الأمريكية (7-10-MI-05)، ومعتمد من قبل آه جمعية القلب الأمريكية تأسست جائزة الباحث (12EIA8270000). وقد أجريت تجارب التدفق الخلوي في التدفق الخلوي VMC مورد مشترك. يتم اعتماد التدفق الخلوي VMC مورد مشترك من قبل الجهاز الهضمي مركز بحوث أمراض فاندربيلت (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
