एक्सॉन कैद और व्यापक समानांतर अनुक्रमण द्वारा ट्यूमर नमूनों में दैहिक आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगा
Summary
हम बारकोड वाले डीएनए पुस्तकालयों और व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण द्वारा नैदानिक ट्यूमर नमूनों में प्रमुख कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का पता लगाने के लिए बाद में संकरण आधारित एक्सॉन कब्जा की तैयारी का वर्णन है. लक्षित एक्सॉन अनुक्रमण इस प्रकार कम आवृत्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता उपज, उच्च throughput, कम लागत, और गहरी अनुक्रम कवरेज का लाभ प्रदान करता है.
Abstract
कुंजी oncogenic परिवर्तन का पता लगा और जांच करने के प्रयासों के कैंसर के रोगियों के लिए उचित उपचार की सुविधा के लिए मूल्यवान साबित किया है. उच्च throughput की स्थापना, व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण कई तरह के परिवर्तन की खोज सहायता प्राप्त की है. इस तकनीक के नैदानिक और translational उपयोगिता बढ़ाने के लिए, प्लेटफार्मों उच्च throughput, लागत प्रभावी, और अपमानित या क्षतिग्रस्त डीएनए की छोटी मात्रा में उपज सकता है कि (FFPE) ऊतकों के नमूनों एम्बेडेड formalin-तय आयल के साथ संगत होना चाहिए. यहाँ, हम व्यापक समानांतर अनुक्रमण द्वारा ताजा जमे हुए और FFPE ट्यूमर में कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का पता लगाने के लिए लक्षित एक्सॉनों के संकरण के आधार पर कब्जा द्वारा पीछा बारकोड वाले और मल्टिप्लेक्स डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी का वर्णन है. इस विधि, अनुक्रम म्यूटेशन की पहचान के लिए सक्षम बनाता संख्या परिवर्तन की नकल, और सभी लक्षित जीन शामिल संरचनात्मक rearrangements का चयन करें. लक्षित एक्सॉन अनुक्रमण टी प्रदान करता हैवह इस प्रकार कम आवृत्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करने, उच्च throughput, कम लागत, और गहरी अनुक्रम कवरेज के लाभ.
Introduction
कुंजी ओंकोजीन और ट्यूमर शमन जीनों में "ड्राइवर" ट्यूमर आनुवंशिक घटनाओं की पहचान कई तरह के कैंसर 1 के निदान और उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण का उपयोग बड़े पैमाने पर अनुसंधान के प्रयासों से हाल के वर्षों 2 में कई तरह के कैंसर से जुड़े जीन की पहचान के लिए सक्षम है. हालांकि, इन अनुक्रमण प्लेटफार्मों आम तौर पर इस प्रकार इस तरह के (FFPE) ट्यूमर के नमूनों एम्बेडेड formalin-तय आयल के रूप में संरक्षित ऊतकों से डीएनए उत्परिवर्तन निस्र्पक और विश्लेषण करने में एक प्रमुख सीमा खड़ी, ताजा जमे हुए ऊतकों से अलग डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. कुशलतापूर्वक और मज़बूती से FFPE ट्यूमर के नमूनों से "कार्रवाई योग्य" जीनोमिक जानकारी के लिए चिह्नित करने के लिए सुधार के प्रयासों को पहले से बैंकिंग नमूनों की पूर्वव्यापी विश्लेषण कर सकें और आगे कैंसर के प्रबंधन के लिए व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए प्रोत्साहित करेंगे.
परंपरागत रूप से, आणविक डीiagnostic प्रयोगशालाओं में इस तरह के डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए सेंगर अनुक्रमण और रियल टाइम पीसीआर के रूप में समय लेने वाली, कम throughput के तरीके पर भरोसा किया है. हाल ही में, मल्टिप्लेक्स पीसीआर या बड़े पैमाने पर spectrometric जीनोटाइपिंग उपयोग उच्च तरीकों कुंजी कैंसर जीन 3-5 में बारम्बार दैहिक परिवर्तन की जांच के लिए विकसित किया गया है. इन तरीकों, तथापि, केवल predesignated "हॉटस्पॉट" परिवर्तन ट्यूमर शमन जीनों में निष्क्रिय परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त कर उन्हें, assayed रहे हैं कि में सीमित कर रहे हैं. व्यापक समानांतर अनुक्रमण आम और दुर्लभ दोनों परिवर्तन के लिए पूरे एक्सॉनों पूछताछ करने की क्षमता है, इस तरह की नकल संख्या लाभ और हानि के रूप में जीनोमिक परिवर्तन की अतिरिक्त कक्षाएं प्रकट करने की क्षमता है, और विषम नमूने 6, में अधिक से अधिक संवेदनशीलता का पता लगाने सहित इन रणनीतियों पर कई लाभ प्रदान करता है 7 . यह सापेक्ष है, हालांकि पूरे जीनोम अनुक्रमण, उत्परिवर्तन की खोज के लिए सबसे व्यापक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता हैly महंगी और डेटा विश्लेषण और भंडारण के लिए बड़े कम्प्यूटेशनल मांगों incurs.
जीनोम का केवल एक छोटा सा अंश नैदानिक ब्याज की हो सकती है, जहां नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए, अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में दो विशेष नवाचारों परिवर्तनकारी किया गया है. सबसे पहले, संकरण आधारित एक्सॉन कब्जा के माध्यम से, एक, लक्षित उत्परिवर्तन रूपरेखा 8 कुंजी कैंसर से जुड़े जीन को इसी डीएनए को अलग कर सकते हैं. दूसरा, आणविक बारकोड (यानी डीएनए अनुक्रम की लंबाई में 6-8 nucleotides) के बंधाव के माध्यम से, एक अनुक्रमण रन प्रति नमूने के सैकड़ों पूल सकते हैं और पूरी तरह से व्यापक समानांतर अनुक्रमण यंत्र 10 की बढ़ती क्षमता का लाभ ले. संयुक्त, इन नवाचारों छोटे कम्प्यूटेशनल जरूरतों 11 के साथ, कम लागत के लिए प्रोफाइल किए गए ट्यूमर सक्षम और उच्च throughput पर. इसके अलावा, विशेष रूप से आवेदन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है केवल उन जीनों को अनुक्रम कवरेज redistributing द्वारा, एक achie कर सकते हैंकम एलील की आवृत्ति की घटनाओं के लिए उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए अधिक से अधिक अनुक्रमण गहराई लिया.
यहाँ हम (सभी प्रोटीन कोडिंग exons कब्जा और 279 कुंजी कैंसर से जुड़े जीन का इंट्रोन्स चयन करने के लिए कस्टम oligonucleotides का उपयोग संकरण द्वारा बारकोड वाले अनुक्रम पुस्तकालय ताल पर एक्सॉन कब्जा इस्तेमाल करता है जो हमारे प्रभाव परख (कार्रवाई कैंसर लक्ष्य की एकीकृत उत्परिवर्तन रूपरेखा), वर्णन तालिका 1 ). इस रणनीति के म्यूटेशन, indels, प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन की पहचान के लिए सक्षम बनाता है, और इन 279 जीनों को शामिल संरचनात्मक rearrangements का चयन करें. हमारे विधि ताजा जमे हुए और FFPE ऊतक के रूप में अच्छी तरह से ठीक सुई रेस्पायरेट्रस और अन्य कोशिका विज्ञान नमूनों दोनों से अलग डीएनए के साथ संगत है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे प्रभाव परख एक उच्च संरेखण दर, उच्च पर लक्ष्य की दर, उच्च लक्ष्य कवरेज, और पता लगाने के म्यूटेशन, indels, और संख्या परिवर्तन की नकल के लिए उच्च संवेदनशीलता पैदा करता है. हम ताजा जमे हुए दोनों से अनुक्रम ड?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ. एग्नेस Viale और MSKCC जीनोमिक्स कोर प्रयोगशाला धन्यवाद. इस प्रोटोकॉल जेफ्री Beene कैंसर रिसर्च सेंटर और किसान परिवार फाउंडेशन की सहायता से विकसित किया गया था.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
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