הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Summary

הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

Abstract

התקדמות בטכניקות תא חי הקרינה מיקרוסקופיה, כמו גם הבנייה של זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון אפשרה להדמיה בזמן אמת של תעבורה והתפשטות של זיהום בנגיף alphaherpes של נוירונים. השירות של חלבוני היתוך ניאון רומן קרום ויראלי, קלפה, וcapsids, בשילוב עם הדמיה תא חי שנוצר על מכלולי חלקיקים נגיפיים העוברים תחבורה בתוך האקסונים. כלים דומים כבר מועסקים בהצלחה לניתוחים של תאי תאים פזורים של חלקיקים נגיפיים לכמת את המספר והמגוון של virions מועבר במגע בין תאים. חשוב לציין, בטכניקות של הדמיה תא החי של תחבורה והתפשטות אנטרוגדית לייצר שפע של מידע ובכלל מהירויות חלקיקי תחבורה, הפצות של חלקיקים, וניתוחים זמניים של לוקליזציה חלבון. לצד טכניקות גנטיות נגיפיות הקלסיים, מתודולוגיות אלה סיפקו תובנות קריטיותלשאלות מכניסטית חשובות. במאמר זה נתאר בפירוט את שיטות ההדמיה שפותחו כדי לענות על שאלות בסיסיות של תחבורה וירוס alphaherpes והתפשטות.

Introduction

זיהום של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) על ידי וירוסי alphaherpes כגון נגיף הרפס סימפלקס (HSV) -1, -2, ונגיף pseudorabies (PRV) כולל מספר שלבים מורכבים ופיקוח הדוק לאורך כל מחזור החיים של הנגיף. תחבורה בתוך הנוירונים של PNS היא קריטית באירועים של שניהם זיהום ויראלי ראשוני והתפשטות בין מארח שלאחר מכן. המנגנונים המולקולריים המווסתים שני מרכיבים של מחזור החיים של הנגיפים; התחבורה בבימויו של מכלולים נגיפיים הרחק מגופי תא בתוך אקסונים (הובלת אנטרוגרדית) והשידור הבא של virions לתאים רגישים (התפשטות אנטרוגרדית) הם חשובים להבנת הפתוגנזה ההרפס.

התחבורה והיציאה של חלקיקים נגיפיים בתאי עצב תלוי בהרכבה של ^1,2 virion זיהומית בוגר. מבחני בעבר קבועים, כולל immunofluorescence (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), שמשו כדי ללמוד את מדינת ההרכבה החלקיקים וprotאינטראקציות ein קשורות לתחבורת virion והתפשטות ^3-6. עם זאת באופי הדינמי של virions ההובלה וממצאים ניסיוניים שהוצג על ידי קיבוע כימי מבולבל פרשנות קבועה תמונות ^7,8. לאחרונה, מספר החלבונים נגיפיים היתוך-ניאון כבר תאר לHSV וPRV שיש השפעות זניחות על תפקוד חלבון. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבוני ניאון אדומים (mCherry או mRFP) fluorophores הם לזווג לעתים קרובות כדי לאפשר הדמיה של שתיים משלושת הרכיבים המבניים של virion בוגר: קופסית, קלפה, וגליקופרוטאין ^9-11. לחיות הדמיה תא של התחבורה אנטרוגדית באמצעות וירוסים כפול שכותרתו מדמיין את מדינת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים במהלך הובלה. fluorophore הדומה הביע זני נגיפים המשמשים לדמיין מספר והמגוון של הגנום נגיפי בעקבות התפשטות ^12,13. את המאפיינים של חלבוני הניאון (הנסקרת ב ^14,15) להשפיע באופן משמעותיהיכולת לדמיין מכלולים נגיפיים או סלולריים. את המאפיינים המהותיים של החלבון פלואורסצנטי, כולל אינטראקציות עצמיות ויציבות, יש לשקול בעת תכנון ובדיקת החלבון fusions חדשני לשימור טבע מהסוג פונקציונלי.

בשיתוף עם איחודי חלבון פלואורסצנטי, שתי היטב מאופיינים במערכות תרבות תאים במבחנה מועסקים הדמיה תא חי של הידבקות בנגיף הרפס: ¹⁶ מנותקים וממודר ¹⁷ (איור 1 א) גרעיני עכברוש (SCG) נוירונים צוואר הרחם מעולים. בשתי המערכות, עוברי של SCG הם גזורים, ניתקו לגופי תא בודדים, ומצופה במבחנת culturing ^18. נוירונים SCG הם חלק ממערכת העצבים האוטונומית ויכולים להיות מתורבתים בקלות ומובחן על ידי גורם גדילה עצבי (NGF) לvivo לשעבר המדינה מקוטבת בוגר. נוירונים SCG ניתקים יוצרים רשת מורחבת של האקסונים המאפשרת Fאו ההדמיה של חלקיקים נגיפיים כפי שהם עוברים הובלת אנטרוגרדית ^6. תרבויות SCG ממודרים לספק בידוד fluidic של גוף התא העצבי (תא S) וTermini האקסון דיסטלי (תא N) ^19. מספר הפרוטוקולים המפורטים לבנייה ולשימוש בתאי עצב ממודר באמצעות שונים Campenot תאי ¹⁷ או ²⁰ מקורי כבר פורסם בעבר. בידוד Fluidic מאפשר לזיהום סלקטיבית של גופי תאים עצביים ואיתור של virions צאצאים לאחר ההובלה לטרמיני האקסון מבודד. ציפוי תאי האפיתל במשך טרמיני לפני ההדבקה מספק תאי נמען להתפשטות זיהום נגיפי.

יש הרבה מרכיבים חיוניים חשובים לכל הניסויים ההדמיה התא חיים, אבל רלוונטי ביותר לפרוטוקולים שלנו הם: רכישה אוטומטית תמונה, תאורת ניאון, מהירות של הדמיה, ושליטה על הסביבה. עבור כל ניסויי ההדמיה, אנו משתמשים,, מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית epifluorescence תאורה (איור 1). מיקרוסקופ בנוי סביב ניקון אקליפס טי הבסיס ומעסיק מספר מערכות מחשב שבשליטת ממונעת למהירות להגדיר מחדש את המיקרוסקופ במהלך רכישת תמונה אוטומטית. תאורה הקרינה, אנו משתמשים במנורת קשת ספקטרום רחב כספית שיכולה להיות מוחלש עם מסנני צפיפות ניטראליים לאורך נתיב ההארה. מסנני עירור להגביל את הספקטרום של תאורת ניאון וכאשר יחד עם מראות dichroic מרובות עוברות ומסנני פליטת הקרינה לדמיין תרכובות ניאון ספציפיות. את מסנני העירור ופליטה הם רכובים בגלגלים עצמאיים, מהר מיתוג סינון כדי לאפשר רכישה רציפה מהירה של ערוצי ניאון שונים. המהירות של רכישת תמונה עוד יותר משופרת עם מצלמת CCD EM-רגישה ומהירה, שימושית לזיהוי של אותות בעצימות נמוכים ותדמית קצרה לקרוא פעמים. שליטה בסביבת microscאופ מושגת עם למעלה שלב חממה מחומם ודוד עדשת מטרה לשמור על דגימות בטמפרטורות גבוהות תוך אווירה מועשרת ₂ CO humidified והוא עבר לחממה. מיקרוסקופ נשמר בחדר חשוך עם טמפרטורת הסביבה נשמר קרוב ל 25 מעלות צלזיוס ואור בחוץ ממוזערים עם וילונות האפלה על כל החלונות. הפרוטוקולים הבאים לתאר את השימוש במערכת זו להובלת אנטרוגרדית ומבחנים להתפשט.

קיים מספר החלופות לשליטה למשתנים של הדמיה תא חי. השליטה על הגדרות מיקרוסקופיה יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכות אוטומטיות תלויות בתוכנת קניינית. תאורת הקרינה ניתן להשיג עם ההלוגן, LED או מקורות לייזר. המהירות של הדמיה היא שונה על ידי המהירות של מיתוג מסנן ואת הזמן כדי להמחיש את האות עם מערכת זיהוי לזווג. בקרה סביבתית יכולה להיות מושגת באמצעות חומרה מיוחדת במיילשלב croscope, מתחם של חלק ממיקרוסקופ בתיבה מחוממת וhumidified או כל, או על ידי העלאת הטמפרטורה של החדר שבו מיקרוסקופיה תבוצע. כל אחת מחלופות אלה יש יתרונות וחסרונות הקשורים למחיר וביצועים.

בפרוטוקול שלאחר מכן, אנחנו פירוט השימוש בהדמית תא חי ללמוד תחבורה אנטרוגדית מהירה והתפשטות של וירוסי אנטרוגדית alphaherpes באמצעות השימוש בזני נגיפי רקומביננטי. הדמיה תא חי בזמן אמת visualizes קופסית, קלפה ו / או גליקופרוטאין שיתוף לוקליזציה על מבנים דינמיים העוברים תחבורה בתוך ¹¹ אקסונים. ההדמיה timelapse הלילה של תרבויות העצביות הממודרות מדמיין יציאה virion axonal וזיהום של תאים רגישים ^12. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מותאמים לשימוש עם מערכת ההדמיה המסוימת שלנו, אבל מוצגים במונחים רחבים ביחס לארבעה היסודות של הדמיה תא חי. בדיון שהיינויפרט עוד כמה אופטימיזציה כי הוא הכרחי לניסויים מוצלחים.

Protocol

סעיף 1 – תנאי בקרה סביבתיים למיקרוסקופ פלואורסצנטי Live-תא 30 דקות לפני כל ניסוי הדמיה להתחבר ולהתחיל לחמם את המיקרוסקופ השלב העליון החממה. הפעל מיקרוסקופ, מקורות אור מועב?…

Representative Results

התחבורה אנטרוגדית יישום של פרוטוקול זה לזיהומים של תרבויות SCG ניתק עם PRV 348, זן PRV רקומביננטי לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו, יש להקל הדמיה של התחבורה אנטרוגדית של virions (איור 3 וסרט משלימה 4). שילוב של החלבונים האלה ההיתוך ?…

Discussion

המטרה של הדמיה תא החי היא התבוננות בתהליכים ביולוגיים כפי שהם מתרחשים ללא שינוי משמעותי על ידי הפעולה של התבוננות. מטרה זו מושגת על ידי אופטימיזציה של שלוש משתנה: איכות סביבה, מהירות של הדמיה, ותאורת פלואורסצנטי. משתני היתר תלויים אלה חייבים להיות מאוזנת כדי להשיג תנ?…

Materials

Name	Company	Catalogue number
35 mm glass bottom culture dish	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
Microscope body	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET
EM-CCD camera	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
Objective lens heater	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements