Alphaherpes वायरस अग्रगामी परिवहन और बिखरा का लाइव सेल इमेजिंग
Summary
Alphaherpes वायरस के संक्रमण का लाइव सेल इमेजिंग निर्देशित परिवहन और कहनेवाला प्रसार के गतिशील घटनाओं के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. यहाँ, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स के संक्रमण के दौरान वायरल विधानसभाओं के दृश्य की सुविधा के लिए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त पुनः संयोजक वायरल उपभेदों कि उपयोग के तरीके मौजूद है.
Abstract
जीवित कोशिका प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक है, साथ ही फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त कि पुनः संयोजक वायरल उपभेदों के निर्माण के क्षेत्र में अग्रिम परिवहन और न्यूरॉन्स के alphaherpes वायरस के संक्रमण के प्रसार का वास्तविक समय दृश्य सक्षम है. जीना सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में वायरल झिल्ली, आवरण, और capsids को उपन्यास फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की उपयोगिता, axons के भीतर परिवहन के दौर से गुजर वायरल कण विधानसभाओं की पहचान की. इसी तरह के उपकरणों को सफलतापूर्वक कोशिकाओं के बीच संचरित virions की संख्या और विविधता यों तो वायरल कणों के प्रसार सेल सेल के विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है. महत्वपूर्ण बात है, अग्रगामी परिवहन और प्रसार का जीना सेल इमेजिंग तकनीक कण परिवहन वेग, कणों का वितरण, और प्रोटीन स्थानीयकरण के अस्थायी विश्लेषण सहित जानकारी का खजाना उपज. शास्त्रीय वायरल आनुवंशिक तकनीक के साथ, इन तरीकों महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की हैमहत्वपूर्ण यंत्रवत सवालों में. इस लेख में हम विस्तार से alphaherpes वायरस परिवहन और प्रसार के बुनियादी सवालों के जवाब देने के लिए विकसित किया गया है कि इमेजिंग विधियों का वर्णन.
Introduction
Alphaherpes ऐसी दाद सिंप्लेक्स वायरस जैसे वायरस (एचएसवी) -1, -2, और pseudorabies वायरस से परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के संक्रमण (इनका उपयोग) वायरल जीवन चक्र के दौरान कई जटिल और उच्च विनियमित कदम शामिल है. पीएन के न्यूरॉन्स के भीतर परिवहन प्राथमिक वायरल संक्रमण और बाद अंतर – मेजबान प्रसार दोनों की घटनाओं के दौरान महत्वपूर्ण है. वायरल जीवन चक्र के दो घटकों मिलाना कि आणविक तंत्र; दूर एक्सोन (अग्रगामी परिवहन) और अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (अग्रगामी प्रसार) को virions की बाद के प्रसारण के भीतर सेल शरीर से वायरल विधानसभाओं के निर्देशन परिवहन समझ दाद रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं.
न्यूरॉन्स में वायरल कणों के परिवहन और निकास एक परिपक्व संक्रामक विरिअन 1,2 के विधानसभा पर निर्भर है. Immunofluorescence (यदि) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) सहित पहले से तय assays है, कण विधानसभा राज्य और prot अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गयाईआईऍन बातचीत विरिअन परिवहन और प्रसार को 3-6 के साथ जुड़े. हालांकि रासायनिक निर्धारण द्वारा शुरू की परिवहन virions और प्रयोगात्मक कलाकृतियों की गतिशील प्रकृति तय छवियों 7,8 की व्याख्या चकित. हाल ही में, वायरल फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की एक संख्या प्रोटीन समारोह पर नगण्य प्रभाव डालता है कि एचएसवी और इनका उपयोग के लिए वर्णित किया गया है. कैप्सिड, आवरण, और ग्लाइकोप्रोटीन 9-11: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mCherry या mRFP) fluorophores अक्सर एक परिपक्व virion के तीन संरचनात्मक घटकों में से दो की इमेजिंग की अनुमति के लिए रखा जाता है. दोहरे लेबल वायरस का उपयोग अग्रगामी परिवहन के सेल इमेजिंग जीते परिवहन के दौरान वायरल कणों की विधानसभा राज्य visualizes. वायरल उपभेदों व्यक्त इसी तरह फ्लोरोफोरे संख्या और प्रसार 12,13 निम्नलिखित वायरल जीनोम की विविधता कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गुणों (14,15 में समीक्षा) बहुत प्रभाववायरल या सेलुलर विधानसभाओं कल्पना करने की क्षमता. जंगली प्रकार कार्यक्षमता के संरक्षण के लिए उपन्यास प्रोटीन fusions के डिजाइन और परीक्षण जब स्वयं बातचीत और स्थिरता सहित फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आंतरिक गुण, विचार किया जाना चाहिए.
फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions, दो विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों में अच्छी तरह से विशेषता के साथ संयोजन के रूप में दाद वायरस के संक्रमण का जीना सेल इमेजिंग के लिए नियोजित कर रहे हैं: अलग 16 और 17 (चित्रा 1 ए) चूहा बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) न्यूरॉन्स बंटे. दोनों प्रणालियों में, भ्रूण एससीजी के एकल कोशिका निकायों के लिए अलग, विच्छेदित कर रहे हैं, और इन विट्रो संवर्धन 18 में के लिए चढ़ाया. एससीजी न्यूरॉन्स स्वायत्त तंत्रिका प्रणाली का हिस्सा हैं और आसानी से एक परिपक्व ध्रुवीकृत राज्य पूर्व vivo में सुसंस्कृत और neuronal वृद्धि कारक (NGF) के द्वारा भेदभाव किया जा सकता है. अलग एससीजी न्यूरॉन्स च की अनुमति देता है कि axons के एक नेटवर्क के विस्तार के लिए फार्मया वे अग्रगामी परिवहन 6 से गुजरना रूप में वायरल कणों के दृश्य. Compartmentalized एससीजी संस्कृतियों neuronal सेल शरीर (एस डिब्बे) और बाहर का अक्षतंतु टर्मिनी (एन डिब्बे) का 19 fluidic अलगाव प्रदान करते हैं. मूल 20 या संशोधित Campenot कक्षों 17 का उपयोग करने के लिए compartmentalized न्यूरॉन्स के निर्माण और उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल की एक संख्या पहले से प्रकाशित किया गया है. Fluidic अलगाव neuronal सेल निकायों और अलग अक्षतंतु टर्मिनी को परिवहन के बाद संतान virions की पता लगाने के चुनिंदा संक्रमण के लिए अनुमति देता है. संक्रमण से पहले टर्मिनी अधिक उपकला कोशिकाओं चढ़ाना वायरल संक्रमण के प्रसार के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं प्रदान करता है.
वहाँ सभी जीना सेल इमेजिंग प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कई आवश्यक तत्व हैं, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक हैं: स्वचालित छवि अधिग्रहण, फ्लोरोसेंट रोशनी, इमेजिंग की गति, और पर्यावरण नियंत्रण. सभी इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हम का उपयोगएक औंधा, स्वचालित, epifluorescence रोशनी खुर्दबीन (चित्रा 1 बी). माइक्रोस्कोप निकॉन ग्रहण तिवारी बेस के चारों ओर बनाया गया है और तेजी से पुन: कॉन्फ़िगर स्वचालित छवि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप को कंप्यूटर नियंत्रित मोटर प्रणालियों की एक संख्या में कार्यरत है. प्रतिदीप्ति रोशनी के लिए, हम रोशनी मार्ग के किनारे तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ तनु हो सकता है कि एक व्यापक स्पेक्ट्रम पारा आर्क दीपक का उपयोग करें. उत्तेजना फिल्टर फ्लोरोसेंट रोशनी के स्पेक्ट्रम की सीमा और बहु - पास dichroic दर्पण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर विशिष्ट फ्लोरोसेंट यौगिकों कल्पना के साथ रखा जाता है. उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों की तेजी अनुक्रमिक अधिग्रहण सक्षम करने के लिए स्वतंत्र है, तेजी से स्विचन फिल्टर पहियों में बढ़ रहे हैं. छवि अधिग्रहण की गति आगे कम तीव्रता का संकेत है और छोटी छवि बार पढ़ने का पता लगाने के लिए उपयोगी एक संवेदनशील और तेजी ईएम सीसीडी कैमरा, के साथ बढ़ाया है. Microsc पर पर्यावरण नियंत्रणope के इनक्यूबेटर गर्म एक मंच के ऊपर और एक humidified और सीओ 2 समृद्ध वातावरण इनक्यूबेटर में पारित हो जाता है, जबकि ऊंचा तापमान पर नमूनों को बनाए रखने के लिए एक उद्देश्य लेंस हीटर के साथ हासिल की है. माइक्रोस्कोप करीब 25 से बनाए रखा परिवेश के तापमान के साथ एक अंधेरे कमरे में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस और सभी खिड़कियों पर अंधकार पर्दे के साथ कम से कम बाहर प्रकाश. निम्नलिखित प्रोटोकॉल अग्रगामी परिवहन और प्रसार assays के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन.
विकल्प की एक संख्या जीना सेल इमेजिंग के चर के लिए नियंत्रित करने के लिए मौजूद हैं. माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स का नियंत्रण स्वयं या मालिकाना सॉफ्टवेयर पर निर्भर स्वचालित प्रणाली के माध्यम से किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति रोशनी हलोजन, एलईडी या लेजर स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है. इमेजिंग की गति फिल्टर स्विचिंग की गति और बनती पहचान प्रणाली के साथ संकेत कल्पना करने के लिए समय से संशोधित किया गया है. पर्यावरण नियंत्रण मील पर विशेष हार्डवेयर के साथ प्राप्त किया जा सकता हैcroscope चरण, सभी या एक गर्म और humidified बॉक्स में माइक्रोस्कोप का हिस्सा है, या माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया जाएगा, जहां कमरे के तापमान को ऊपर उठाने के द्वारा के बाड़े. इन विकल्पों में से प्रत्येक की लागत और प्रदर्शन करने के लिए संबंधित फायदे और नुकसान है.
बाद में प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से पुनः संयोजक वायरल उपभेदों के उपयोग के माध्यम से तेजी से अग्रगामी परिवहन और alphaherpes वायरस के अग्रगामी प्रसार का अध्ययन करने के लिए जीना सेल इमेजिंग का उपयोग. वास्तविक समय रहते सेल इमेजिंग कैप्सिड, आवरण, और / या axons 11 भीतर परिवहन के दौर से गुजर गतिशील ढांचे पर ग्लाइकोप्रोटीन सह स्थानीयकरण visualizes. Compartmentalized neuronal संस्कृतियों के रातों रात timelapse इमेजिंग अतिसंवेदनशील कोशिकाओं 12 की axonal विरिअन निकास और संक्रमण visualizes. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल हमारे विशेष इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन जीना सेल इमेजिंग के चार तत्वों के सापेक्ष व्यापक संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे हैं. चर्चा में हमआगे विस्तार के सफल प्रयोग के लिए आवश्यक है कि अनुकूलन के कुछ होगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
वे अवलोकन के अधिनियम द्वारा महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना हो ही जीना सेल इमेजिंग के लक्ष्य जैविक प्रक्रियाओं को देख रहा है. पर्यावरण नियंत्रण, इमेजिंग की गति, और प्रतिदीप्ति रोशनी: इस लक्ष्य को तीन चर अन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वामपंथी उग्रवाद और आर.के. स्वास्थ्य अनुदान R37 NS033506-16 और R01 NS060699-03 के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित हैं. एमपीटी एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी Postdoctoral रिसर्च फैलोशिप (पीएफ-10-057-01-एमपीसी) द्वारा समर्थित किया गया था. डा. मैथ्यू लीमन और डॉ. ओरेन Kobiler की सलाह और ज्ञान खुर्दबीन विन्यास और जीना सेल इमेजिंग तरीकों को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. हम भी माइक्रोस्कोप का अधिग्रहण, स्थापना और प्रदर्शन में उनकी तकनीकी सहायता के लिए नील बारलो और Nikon उपकरण के ब्रायन टी. भैया को धन्यवाद देती हूं.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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