ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ
Summary
私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。
Abstract
ここで、我々は、同時に光ファイバー微小球ベースの抗体アレイを用いて唾液中に6つのタンパク質を測定するためのプロトコルを記載している。採用免疫アレイ技術は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスフェアベースのサスペンションアレイ製造の利点を兼ね備えています。ビデオプロトコルに記載のように、市販さ4.5μmのポリマーミクロスフェアは、物理的に微小球の内部に閉じ込められた二つの蛍光色素の濃度によって区別7種類、に符号化された。表面にカルボキシル基を含有する符号化されたマイクロスフェアは、EDC / NHSカップリング化学を介してモノクローナル捕捉抗体で修飾した。タンパク質マイクロアレイを組み立てるために、符号化及び官能化ミクロスフェアの異なる種類を混合し、無作為に化学的に光ファイバ束の近位端にエッチングされた4.5μmのマイクロウェル内に堆積される。光ファイバ束は、キャリアの両方としておよびmを画像化するために使用したicrospheres。一旦組み立てられると、マイクロアレイは診療所から収集された唾液上清中のタンパク質を捕捉するために使用した。検出は、ストレプトアビジン結合蛍光プローブ、R-フィコエリスリンと異なる分析物について、ビオチン化検出抗体の混合物を用いたサンドイッチ免疫測定法に基づいた。マイクロアレイは、微小球の登録およびアッセイシグナルのための1のための3つの異なるチャネル、2に蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光顕微鏡写真は、次いで、デコードされMATLABに自家製のアルゴリズムを用いて分析した。
Introduction
1990年代半ばにマークSchenaとその共同研究者によって報告される最初のマイクロアレイので、この強力なツールは、生物学的研究1の多くの分野で利用されている。同時に、血液などの体液の診断、内の複数のタンパク質を検出する抗体マイクロアレイは、臨床診断やバイオマーカーのスクリーニング2月10日の重要な用途がある。唾液は、血液と同じ分析物の多くを含む、唾液の収集は、安全で非侵襲的であるため、血液の好ましい代替手段として考えられており、最小限の訓練を受けた医療従事者11-13によって行うことができる。現在、唾液サンプルを用いて多重化されたタンパク質の分析は、標的分析物14の濃度が低いと、異なるバイオマーカー15の広い濃度範囲を含むいくつかの重要な要因によって制限される。
。ここで、我々は、6つのタンパク質の解析を実証する：ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-8（IL-8）、上皮成長因子（EGF）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP-9）、インターロイキン-1β（IL-1β） 。方法の性能は、最初に標準溶液組換え被分析タンパク質を構成し、ブロッキング緩衝液を使用して確認した。別の慢性呼吸器疾患の患者さんだけでなく、健常対照から収集された実際の唾液サンプルにも十分な性能を試験した。プロトコルは、他のタンパク質分析物と他のマイクロスフェアベースのアッセイに適用可能であるべきである。それは、ANと比較して、高速、正確、かつ広いダイナミックレンジを有するいくつかのタンパク質の低濃度の再現性の同時分析、最小限の非特異的相互作用、還元試料消費、および低コストを可能にするように、このプラットフォームは、分析化学の分野にかなりの利点を提供する類似酵素免疫測定法（ELISA法）。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究者は、次の手順に特別な注意を払う必要があります：より良いデコード精度のためには、マイクロスフェアが均一にすべてのインキュベーションに懸濁し、検証し、マイクロスフェアの符号化手順の間にステップを洗浄する必要がある。また、符号化されたマイクロスフェアは、実験全体を通して、光から保護される必要がある。適切な符号化及び記憶手順に従って、我々は、全体の復?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所（助成08UDE017788-05）によってサポートされていました。 EBPはまた、科学技術のためのスペイン財団（FECYT）からの支援を認めるものです。著者は、原稿の重要な読書のためにShonda T.ゲイロードとPratyusha Mogalisettiに感謝します。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
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