Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Messen von sechs Proteine im Speichel unter Verwendung einer faseroptischen Mikrokügelchen basierende Antikörperarray. Die Immuno-Array-Technologie eingesetzt verbindet die Vorteile der Mikrokugel-Suspension auf Basis der Arrayherstellung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Wie in der Video-Protokoll beschrieben, wurden im Handel erhältliche 4,5 um Polymermikrokugeln in sieben verschiedenen Typen, durch die Konzentration der beiden Fluoreszenzfarbstoffe physikalisch innerhalb der Mikrokügelchen eingeschlossen differenziert codiert. Die codierten Mikrosphären, die Oberfläche Carboxyl-Gruppen wurden mit monoklonalen Fänger-Antikörper über EDC / NHS-Kopplungschemie modifiziert. Um das Protein-Mikroarray zusammenzubauen, wurden die unterschiedlichen Typen von kodierten und funktionalisierten Mikrokugeln gemischt und zufällig in 4,5 um Vertiefungen, die an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels chemisch geätzt wurden abgeschieden. Die Glasfaserbündel wurde sowohl als Träger und für die Abbildung der m verwendeticrospheres. Nach der Montage wurde die Microarray verwendet, um Proteine im Speichel Überstand aus der Klinik gesammelt zu erfassen. Der Nachweis erfolgte auf einem Sandwich-Immunoassay unter Verwendung einer Mischung von biotinylierten Detektionsantikörper für unterschiedliche Analyten mit einer Streptavidin-konjugierten Fluoreszenzsonde, R-Phycoerythrin basiert. Der Mikroarray wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in drei Kanäle, zwei für Mikrokügelchen Registrierung und eine für das Assay-Signal abgebildet. Die Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden dann dekodiert und mit einer hausgemachten Algorithmus in MATLAB analysiert.
Introduction
Seit der ersten Microarray von Mark Schena und Mitarbeiter in der Mitte der 1990er Jahre berichtet, hat dieses leistungsstarke Werkzeug in vielen Bereichen der biologischen Forschung 1 verwendet worden. Antikörper-Microarrays, die gleichzeitig mehrere Erfassungs Proteine in diagnostischen Flüssigkeiten, wie Blut, haben wichtige Anwendungen in der klinischen Diagnostik und Screening Biomarker 2-10. Speichel enthält viele der gleichen Analyten wie Blut, hat als eine bevorzugte Alternative zu Blut in Betracht gezogen worden, weil Speichel Sammlung ist sicher, nicht-invasive, und kann von minimal 11 bis 13 ausgebildetes medizinisches Personal durchgeführt werden. Derzeit ist Multiplexproteinanalyse mit Speichelproben von mehreren wichtigen Faktoren ab, einschließlich der niedrigen Konzentration der Ziel-Analyt 14 und dem weiten Konzentrationsbereich der verschiedenen Biomarker 15 begrenzt.
.Hier zeigen wir die Analyse von sechs Proteine: human vascular endothelial growth factor (VEGF), Interferon-gamma-induziertes Protein 10 (IP-10), Interleukin-8 (IL-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Matrix Metallpeptidase 9 (MMP-9), Interleukin-1 beta (IL-1β) . Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens wurde zunächst unter Verwendung von Standardlösungen bilden Analyten rekombinanten Proteinen und Blocking-Puffer überprüft. Echtspeichelproben von Patienten mit verschiedenen chronischen Atemwegserkrankungen sowie gesunden Kontrollen gesammelt wurden auch mit zufriedenstellenden Leistung getestet. Das Protokoll ist anwendbar auf andere Protein Analyten und anderen Mikrokügelchensystem sein. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile für den Bereich Analytische Chemie, wie es ermöglicht eine schnelle, genaue und reproduzierbare gleichzeitige Analyse von geringen Konzentrationen von mehreren Proteinen mit einem breiten Dynamikbereich, minimale unspezifische Wechselwirkungen, reduzierte Probenverbrauch und niedrige Kosten im Vergleich zu einer analog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Forscher sollten Sie besonders auf die folgenden Schritte beachten: für bessere Dekodierung Genauigkeit, ist es notwendig zu überprüfen, die Mikrokugeln wurden homogen in allen Inkubation suspendiert und Waschschritte während der Mikrosphären Verschlüsselungsverfahren. Darüber hinaus müssen die codierten Mikrosphären, von Licht während des gesamten Experiments zu schützen. Nach korrekter Kodierung und Lagerungsverfahren, fanden wir, dass die Gesamt Decodierung Genauigkeit von über 99% lag. Die codierten Mikr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Zuschuss 08UDE017788-05) unterstützt. EBP erkennt auch Unterstützung von der spanischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FECYT). Die Autoren danken Shonda T. Gaylord und Pratyusha Mogalisetti für das kritische Lesen des Manuskripts.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
