Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих
Summary
Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами.
Abstract
Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. Современные протоколы для решения этих вопросов, включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. Кол колонии и защиты гентамицин анализы только оценки жизнеспособности всей популяции бактерий и не в состоянии определить индивидуальный бактериальную жизнеспособность. Электронной микроскопии может быть использован для определения жизнеспособности отдельных бактерий и предоставить информацию относительно их локализации в клетках-хозяевах. Тем не менее, бактерии часто показывают диапазон плотностей электронов, что делает оценка жизнеспособности трудно. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами. Эти анализы были разработаны первоначально для оценки выживаемости гонококков в первичных человеческих нейтрофилов, но должно бытьpplicable для любого взаимодействия бактерия-клетки-хозяина. Эти протоколы объединить мембранные проницаемым флуоресцентные красители (SYTO9 и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола [ДАПИ]), который окрашивает все бактерии, с мембранными непроницаемый флуоресцентных красителей (пропидийиодидом и Sytox зеленый), которые доступны только для нежизнеспособные бактерии. До эукариотической клеточной проницаемости, антитело или флуоресцентный реагент добавляют к идентификации внеклеточных бактерий. Таким образом, эти анализы дискриминации жизнеспособность бактерий приверженцем и внутри эукариотических клетках. Протокол также предоставляется для использования жизнеспособность красителей в сочетании с флуоресцентными антителами к эукариотических клеток маркеров, для того, чтобы определить внутриклеточную локализацию отдельных бактерий. Бактериальные жизнеспособности красители, обсуждаемые в этой статье, являются чувствительными дополнением и / или альтернативой традиционным методам микробиологических оценить жизнеспособность отдельных бактерий и предоставить информацию о том, где бактерии выживают в клетке-хозяинес.
Introduction
Существует динамическое взаимодействие и коэволюция между бактериями и хозяев, в которых они проживают. Бактерии развивались приверженности органеллы, секреции системы, и / или способность производить токсины, которые позволяют их производственного заражение хозяина фагоцитарную и не-фагоцитов. Бактерии также должна будет бороться с признанием и антимикробных деятельности иммунной системы хозяина. Хозяин иммунная система состоит из врожденного и приобретенного компонентов, включая физических и химических барьеров, иммунных клеток, системы комплемента, и других компонентов гуморального иммунитета. Хотя многие бактерии чувствительны к гибели и очистки с помощью многослойной иммунного ответа, некоторые патогенные и условно-патогенные бактерии развивались механизмы заражают различные клетки-хозяева и саботировать зазор иммунного ответа 1. Гонококков является одним из примеров бактериальным патогеном что в высшей степени приспособлен упорствовать в своем человеческого организма. N. гонореи легко колонизирует просвета поверхности эпителиальных клеток слизистых урогенитального тракта, глотки, конъюнктивы, и прямой кишки. Колонизация вызывает обильное вербовку нейтрофилов в местах слизистой. Нейтрофилов профессиональные фагоциты, которые обладают различными антимикробными процессов, чтобы убить микроорганизмы, однако Н. гонореи способен выживать в присутствии нейтрофилов 2-5. Принципы действия бактериальных патогенов, таких как N. гонореи подорвать, подавить и захватить иммунный ответ, в конечном счете выжить в обычно враждебной среде принимающих имеет решающее значение для разработки новых методов лечения для борьбы с инфекционными заболеваниями.
Экспериментальные протоколы часто используются, чтобы исследовать выживаемость бактерий в клетках-хозяевах включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. В подсчета колоний анализов, население зараженных клеток лизируется (например, с помощью моющего средства для WHич бактерии устойчивы), чтобы освободить бактерии. Лизаты разбавляют и высевают на агар на основе информации, а колониеобразующих единиц в лизатах перечислены для каждой временной точки и / или экспериментальных условиях. Этот подход сообщает жизнеспособность всей популяции бактерий, но не способны дифференцироваться между внутриклеточным и внеклеточным выживания. Вариация на количество колоний анализа, анализа защиты гентамицин, специально измеряет внутриклеточный выживаемость бактерий, основанный на неспособности к антибиотикам гентамицин, чтобы пересечь эукариотической мембрану плазмы 6. Тем не менее, этот анализ зависит от бактерий, являющихся восприимчивыми к гентамицину погибли на (или другого антибиотика, который аналогичным образом эукариотической мембраной impermeant) и неспособности антибиотика, чтобы иметь доступ к внутренним бактерий. Таким образом, защита гентамицин анализ не может быть эффективным для изучения всех видов бактерий или при рассмотрении выживаемость бактерий в сильнопиноцитозные клетки, такие как нейтрофилы. Ни один из этих подходов раскрывает внутриклеточную локализацию или другой поведение отдельных бактерий (например, если бактерии образуют агрегаты или микроколонии, которые ведут себя иначе, чем отдельных бактериальных клеток). Другим часто используемым подходом для изучения жизнеспособности отдельных внешних и внутренних бактерий тонкого раздел просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Этот подход имеет то преимущество, что она может предоставить информацию о местоположении бактерий в клетках-хозяевах (например Фагосомы, цитоплазма, аутофагосом), которые могут быть дополнительно исследованном иммуноэлектронной микроскопии с золотом в сочетании антител против внутриклеточных маркеров. Тем не менее, электронная микроскопия не особенно чувствительны при оценке бактериальной жизнеспособности. Когда срезы окрашивали уранилацетатом, цитратом свинца или других электронно-плотные реагенты и отображаемого с помощью электронной микроскопии, электронно-плотные бактерии считаются жизнеспособными и электроэлектрон-Lucent нежизнеспособным 7,8. Однако это предположение переоценивает бактериальную жизнеспособность, так как только те мертвых бактерий с сильно разрушенных мембран и лишены цитоплазмы появляются электронно-Lucent. Кроме того, некоторые виды бактерий могут вывести диапазон плотности электронов в зависимости от их стадии роста, что делает его трудно определить жизнеспособность.
В качестве альтернативы или в дополнение к этим широко используемых методов, здесь мы предлагаем протоколы и обоснование для использования флуоресцентных красителей, которые указывают бактериальной жизнеспособности для оценки выживаемости бактерий, прикрепленных к и усвоены клеток-хозяев. Для идентификации внеклеточных бактерий, инфицированные клетки сначала подвергают воздействию флуоресцентного реагента, такого как лектина или бактерии-специфические антитела. Инфицированные клетки затем проницаемыми и подвергаются ДНК-специфичных красителей, которые дифференциально доступны для бактерий с нетронутыми против деградированных мембран, в качестве суррогата жизнеспособность бактерий. В первом рrotocol, мембрана SYTO9 проницаемой краситель определяет общее бактериальное население, в то время как иодид пропидия доступна только для тех бактерий, которые скомпрометированы мембраны и, таким образом, считается нежизнеспособным. Пропидийиодидом и SYTO9 были использованы для оценки жизнеспособности бактерий в биопленки, различать патогенные от непатогенных бактерий и перечислить жизнеспособных воду бактерий 9-12. Во второй схеме, 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) определяет общие бактерии, в то время как Sytox Зеленый доступен только на нежизнеспособных населения. Эти пары жизнеспособность красителя может быть объединен с иммунофлюоресценции, чтобы определить местоположение каждой бактерии в отношении представляющего интерес белка, например, чтобы определить бактериальную внутриклеточную локализацию. Использование этих анализов содержит ключевую представление о взаимодействий, которые приводят к гибели бактерий или выживание при заражении клеток-хозяев. Протоколы, изложенные в этой статье, были использованы для оценки жизнеспособностиН. гонореи, который прилагается к и внутри первичных человеческих нейтрофилов, в том числе в разных популяциях нейтрофилов фагосом 5,13,14. Тем не менее, эти протоколы могут быть применены для оценки жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий в профессиональных фагоцитах, непрофессиональной фагоцитов, и простейших 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлены два протокола, которые используют связывания ДНК и жизнеспособность красители в сочетании с флуоресцентным лектина, чтобы идентифицировать живые и мертвые бактерии, прикрепленные к и внутри клеток человека. Поскольку оба протокола эффективно различать в прямом эф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Asya Смирнов и Лаура Gonyar за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH R00 TW008042 и R01 AI097312 в AKCMBJ была частично поддержана NIH T32 AI007046.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
