Fluorescensmikroskopi Metoder för att fastställa livskraft bakterier i föreningen med däggdjursceller
Summary
Centralt i området för bakteriell patogenes är möjligheten att fastställa om och hur mikrober överleva efter exponering för eukaryota celler. Den här artikeln beskriver protokoll för användning av fluorescerande färger som avslöjar lönsamheten för enskilda bakterier inom och i samband med värdceller.
Abstract
Centralt i området för bakteriell patogenes är möjligheten att fastställa om och hur mikrober överleva efter exponering för eukaryota celler. Nuvarande protokoll för att hantera dessa frågor är mikroorganismer analyser, gentamicin skydd analyser och elektronmikroskopi. Mikroorganismer och gentamicin skydd analyser bara bedöma lönsamheten av hela bakteriepopulationen och inte kan bestämma enskilda bakterie livskraft. Elektronmikroskopi kan användas för att bestämma viabiliteten av enskilda bakterier och tillhandahålla information beträffande deras lokalisering i värdceller. Men bakterier visar ofta en rad av elektrontäthet, vilket gör bedömningen av lönsamheten svårt. Den här artikeln beskriver protokoll för användning av fluorescerande färger som avslöjar lönsamheten för enskilda bakterier inom och i samband med värdceller. Dessa analyser utvecklades ursprungligen för att utvärdera överlevnaden av Neisseria gonorrhoeae i primära humana neutrofiler, men bör vara enpplicable till varje interaktion bakterie-värdcell. Dessa protokoll kombinerar membrangenomträng fluorescerande färgämnen (SYTO9 och 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), som färgar alla bakterier, med membrantäta fluorescerande färgämnen (propidiumjodid och Sytox gröna), som endast är tillgänglig för icke-livsdugliga bakterier. Före eukaryot cell permeabilization, är en antikropp eller ett fluorescerande reagens för att identifiera extracellulära bakterier. Således dessa analyser diskriminera livskraft bakterier anhängare till och inuti eukaryota celler. Ett protokoll är också anordnad för att använda dess viabilitet färgämnen i kombination med fluorescerande antikroppar mot eukaryota cellmarkörer, för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av individuella bakterier. De bakteriella viabilitet färgämnen diskuteras i denna artikel är en känslig komplement och / eller alternativ till traditionella mikrobiologiska tekniker för att utvärdera lönsamheten för enskilda bakterier och ge information om var bakterier överleva i värdcellener.
Introduction
Det finns en dynamisk interaktion och co-evolution mellan bakterier och värdar där de är bosatta. Bakterier har utvecklats vidhäftningsorganeller, sekretionssystem, och / eller förmågan att producera gifter som gör att deras produktiva infektion av värd fagocytiska och icke-fagocyterande celler. Bakterierna måste även brottas med erkännande och antimikrobiella aktiviteter värdens immunsystem. Värdimmunsystem består av medfödda och adaptiva komponenter inklusive fysiska och kemiska barriärer, immunceller, komplementsystemet, och andra komponenter i humoral immunitet. Medan många bakterier är känsliga för dödande och godkännande från den flerskiktade värd immunsvar, har vissa patogena och opportunistiska bakterier utvecklat mekanismer för att infektera en mängd olika värdceller och undergräva godkännande av värdimmunsvar 1. Neisseria gonorrhoeae är ett exempel på en bakteriell patogen som är starkt anpassad till framhärdar i sin mänskliga värden. N. gonorrhoeae koloniserar lätt de luminala ytorna hos mukosala epitelceller i den urogenitala kanalen, svalget, bindhinnan, och rektum. Colonization utlöser den rikliga rekrytering av neutrofiler vid slemhinnor. Neutrofiler är professionella fagocyter som besitter en rad olika antimikrobiella processer för att döda mikroorganismer, men N. gonorrhoeae har förmåga att överleva i närvaro av neutrofiler 2-5. Att förstå hur bakteriella patogener som N. gonorrhoeae omstörta, undertrycka, och kapa immunsvaret att slutligen överleva i normalt fientliga värdmiljöer är avgörande för utvecklingen av nya terapier för att bekämpa smittsamma sjukdomar.
Experimentella protokoll som ofta används för att undersöka bakteriell överlevnad i värdceller omfattar mikroorganismer analyser, gentamicin skydd analyser och elektronmikroskopi. I mikroorganismer analyser, är en population av infekterade celler lyseras (till exempel med ett rengöringsmedel för WHich bakterierna är resistenta) att befria bakterierna. Lysaten späddes och ströks ut på agar-baserade medier, och kolonibildande enheter i lysaten uppräknas för varje tidpunkt och / eller försöksbetingelse. Detta tillvägagångssätt rapporterar livskraft hela bakteriepopulationen, men är inte i stånd att skilja mellan intracellulära och extracellulära överlevnad. En variant på mikroorganismer analysen, gentamicin skydd analysen mäter specifikt intracellulär bakterie överlevnad, baserat på oförmågan hos de antibiotika gentamicin att korsa den eukaryota plasmamembranet 6. Emellertid är denna analys beroende på bakterierna är känsliga för avdödning genom gentamicin (eller ett annat antibiotikum som är på liknande sätt eukaryot membran impermeant) och oförmågan av antibiotikumet att få tillträde till interna bakterier. Därför kan en gentamicin skydd analys inte vara effektiv för granskning av alla bakteriearter eller vid prövningen av bakteriell överlevnad i hög gradpinocytic celler, såsom neutrofiler. Ingen av dessa metoder avslöjar subcellulära lokalisering eller annat beteende av enskilda bakterier (t.ex. om bakterierna bildar aggregat eller mikrokolonier som beter sig annorlunda än enskilda bakterieceller). En annan ofta använd metod för att undersöka genomförbarheten av de enskilda interna och externa bakterier är tunn sektion transmissionselektronmikroskop (TEM). Denna metod är fördelaktig genom att den kan ge information om var bakterierna i värdceller (t.ex. phagosome, cytoplasman, autophagosome), som kan undersökas vidare genom immunelektronmikroskopi mikroskopi med guldkopplade antikroppar mot subcellulära markörer. Dock är elektronmikroskopi inte särskilt känslig på att bedöma bakterie livskraft. När inbäddade sektioner färgades med uranylacetat, bly citrat, eller andra elektrontäta reagens och avbildas genom elektronmikroskopi, är elektrontäta bakterier anses livskraftig och elekTRON-Lucent nonviable 7,8. Dock överskattar detta antagande bakteriell bärkraft, eftersom endast de döda bakterier med allvarligt störda membran och saknar cytoplasman visas elektron-Lucent. Dessutom kan vissa bakteriearter visa ett urval av elektrontäthet beroende på stadium av tillväxt, vilket gör det svårt att avgöra lönsamheten.
Som ett alternativ eller komplement till dessa allmänt använda metoder, här ger vi protokoll och logisk grund för användningen av fluorescerande färger som indikerar bakteriell livskraft för att bedöma överlevnaden av bakterier knutna till och internaliserade av värdceller. För att identifiera extracellulära bakterier, infekterade cellerna först exponeras för ett fluorescerande reagens, såsom en lektin eller bakterier-specifika antikroppen. De infekterade cellerna därefter permeabiliseras och utsätts för DNA-specifika färgämnen som är differentiellt tillgängliga för bakterierna med intakt vs nedbrutna membraner, som ett surrogat för bakteriell livsduglighet. I det första protocol, identifierar membranet genomsläppliga färgämnet SYTO9 den totala bakteriepopulationen, medan propidiumjodid är endast tillgänglig för de bakterier som har komprometterade membran och därmed anses icke-livsdugliga. Propidiumjodid och SYTO9 har använts för att utvärdera bakteriell viabilitet i biofilmer, diskriminera patogen från icke-patogena bakterier, och räkna livskraftiga vattenburna bakterier 9-12. I det andra protokollet, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) identifierar totala bakterier, medan Sytox Green är endast tillgänglig för icke-livsdugliga befolkningen. Dessa viabilitet färgämnesparen kan kombineras med immunofluorescens för att bestämma varje bakterie läge i förhållande till ett protein av intresse, till exempel för att definiera bakterie subcellulär lokalisering. Användningen av dessa analyser ger viktig inblick i de interaktioner som resulterar i bakteriedödande eller överlevnad under infektion av värdceller. De protokoll som beskrivs i denna artikel användes för att bedöma lönsamheten förN. gonorrhoeae som är fäst vid och inuti primära humana neutrofiler, även i olika populationer av neutrofila fagosomer 5,13,14. Dock kan dessa protokoll användas för att bedöma lönsamheten av grampositiva och gramnegativa bakterier i professionella fagocyter, icke-professionella fagocyter och protozoer 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenteras två protokoll som använder DNA-bindande och lönsamhet färgämnen i samband med ett fluorescerande lektin att identifiera levande och döda bakterier fästa vid och inuti mänskliga celler. Eftersom båda protokollen effektivt diskriminera live från döda bakterier, valet av vilket protokoll som ska användas beror på målet med försöket. Det första protokollet använder propidiumjodid för att upptäcka icke-livsdugliga bakterier och SYTO9 att upptäcka intakta bakterier. Visas i figur …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Asya Smirnov och Laura Gonyar för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag NIH R00 TW008042 och R01 AI097312 till AKCMBJ stöddes delvis av NIH T32 AI007046.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
