Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement<em> In Vitro</em> Comment la germination des contrôles endosperme des semences dans<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.
Abstract
L'endosperme de Arabidopsis est constitué d'une seule couche de cellules entourant l'embryon mature et jouant un rôle essentiel pour empêcher la germination des graines ou dormants que des graines non dormantes irradiés par une impulsion de lumière rouge lointain (FR). Afin d'obtenir d'autres renseignements sur les mécanismes génétiques moléculaires qui sous-tendent l'activité répressive de germination exercée par l'endosperme, un test "graines de literie de manteau" (ARA) a été conçu. L'ARA est une procédure de dissection séparer physiquement les téguments et les embryons de graines, qui permet de surveiller la croissance des embryons sur une couche sous-jacente de téguments. Remarquablement, l'ARA reconstitue la germination activités répressives de l'enveloppe de la graine dans le contexte de la dormance des graines et de contrôle FR-dépendante de la germination des graines. Depuis l'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires, les voies génétiques contrôlant la germination et spécifiquement operating dans l'endosperme et de l'embryon peut être disséqué. Ici, nous détaillons la procédure d'assembler un appareil respiratoire autonome.
Introduction
Dans les graines matures Arabidopsis, le tégument est composé de la testa, une couche externe de tissu mort d'origine maternelle, et l'endosperme, une seule couche de cellules de tissus vivants entourant directement l'embryon 1. L'endosperme et l'embryon sont dérivés d'événements de fertilisation distinctes: l'endosperme est un tissu triploïde avec deux maternel et un génome paternel tandis que l'embryon est un tissu diploïde avec une mère et un génome paternel 2.
La fonction principale traditionnellement attribué à l'endosperme est celui d'un tissu nutritif. Cependant, il est de plus en plus évident que l'endosperme joue également un rôle central pour contrôler la germination des graines. Cette notion est devenue la première apparente dans le cas de dormance, un trait présentée par graines nouvellement produites. Graines dormantes ne germent pas, malgré la présence de conditions favorables de germination. Graines perdent leur dormance après une période de maturation et deviennent nondormant, c'est à dire qu'ils vont germer lorsqu'il est exposé à des conditions favorables de germination. Chez de nombreuses espèces de plantes, y compris la plante modèle Arabidopsis, le tégument est absolument nécessaire pour empêcher la germination des graines dormantes depuis élimination du tégument déclenche la croissance embryonnaire et l'écologisation de 3,4. Chez Arabidopsis, Bethke et al. Observé que la germination est resté refoulé après avoir enlevé le testa tout en maintenant l'endosperme entourant l'endosperme 5. Ces observations indiquaient fortement que l'endosperme est le tissu à l'intérieur de l'enveloppe de la graine exerçant une activité répressive sur l'embryon. Cependant, semences expériences d'enlèvement de couche ne contribuent pas nécessairement à clarifier la nature de l'activité répressive de germination fournies par le tégument de la graine, ni d'identifier les gènes qui la mettent en œuvre.
Nous avons récemment lancé un essai graines de literie de manteau (ARA) où les téguments et les embryons sont physiquement séparés, mais conservés à promité de sorte que l'activité répressive de la germination fourni par l'endosperme est maintenue 6. L'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes, et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires. En conséquence, les voies génétiques contrôlant la germination et fonctionnant spécifiquement dans l'endosperme et l'embryon peut être disséqués. L'ARA a été utilisé dans le cadre de la dormance de montrer que l'endosperme libère l'acide abscissique phytohormones (ABA) en direction de l'embryon à réprimer sa croissance 6. De plus, nous pourrions utiliser l'ARA à identifier les voies de signalisation qui opèrent dans l'endosperme et tissus embryonnaires de promouvoir la dormance.
Le rôle de l'endosperme de contrôler la germination a été renforcée en considérant le cas de semences non dormantes exposés à une impulsion de rouge lointain (FR) lumière. Tôt sur l'imbibition une impulsion de lumière FR est connu pour inhiber la germination 7,8. Lorsque les téguments ont été retirés de graines d'une impulsion de lumière FRa été incapable d'inhiber la germination, ce qui suggère fortement que l'endosperme peut également réprimer la germination des graines non dormantes 9. Fait étonnant, l'ARA peut également être utilisé pour récapituler FR-dépendante inhibition de la germination. Cela a permis de montrer que cette FR-dépendante inhibition de la germination des graines est également un processus impliquant ABA libération de l'endosperme 9. En outre, l'ARA a permis d'identifier les différentes voies de signalisation lumineuse opérant dans l'endosperme et l'embryon de contrôler la germination des graines dormantes en réponse à des signaux lumineux 9,10.
L'ARA apparaît donc comme une technique fiable pour explorer la fonction de l'endosperme dans le contexte du contrôle de la germination des graines. Il est également un outil puissant pour évaluer in vitro si les gènes soupçonnés de contrôler la germination opèrent dans l'albumen, l'embryon ou les deux tissus. Ici, nous détaillons les différentes étapes nécessaires à l'assemblage d'un appareil respiratoire autonome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de la literie de tégument (ARA) décrite ici est en principe applicable à toute circonstance où la germination des graines d'Arabidopsis est bloqué (ou retardée) et où l'endosperme est soupçonné de mettre en œuvre cette arrestation. Ce dernier peut être attestés par enlever le tégument (testa et endosperme) et en observant que le produit de croissance embryonnaires rapides par rapport à celle observée lorsque les embryons sont entourés par l'enveloppe de la graine. La germin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national suisse de la science et de l'Etat de Genève.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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