Enteriske Bakteriell invasjon av intestinal Epitelceller<em> In Vitro</em> Er dramatisk forbedret ved hjelp av en vertikal Diffusion Chamber Model

Summary

Utføre cellekultur-analyser for å undersøke bakteriell vedheft og invasjon under aerobe forhold er vanligvis representative for<em> In vivo</em> Miljøet. En vertikal Diffusion Chamber modellen lar studie av interaksjoner av den menneskelige organismen<em> Campylobacter jejuni</em> Med intestinale epitelceller under mer<em> In vivo</em>-Lignende tilstander, noe som resulterer i økt bakteriell invasjon.

Abstract

Interaksjonene mellom bakterielle patogener med vertceller har blitt undersøkt grundig ved hjelp av in vitro cellekultur metoder. Men da slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold, disse in vitro-modeller kan ikke nøyaktig representere in vivo miljøet hvor vert-patogen interaksjoner finner sted. Vi har utviklet en in vitro modell av infeksjon som tillater coculture av bakterier og vertsceller under forskjellige medium-og gass-forhold. Vertikal Diffusion Chamber (VDC) modell etterligner forholdene i tarmen der bakterier vil være under forhold med svært lite oksygen mens vev vil bli levert med oksygen fra blodet. Plassere polariserte intestinal epitelceller (IEC) monolagene dyrket i Snapwell setter inn et VDC skaper separate apikale og basolateral avdelinger. Den basolateral kammer er fylt med cellekulturmedium, forseglet og perfundert med oksygen wHilst den apikale kupé er fylt med kjøttkraft, holdes åpne og ruges i henhold microaerobic forhold. Både Caco-2 og T84 IECS kan opprettholdes i VDC under disse forholdene uten noen tilsynelatende skadelige effekter på celle overlevelse eller monolag integritet. Coculturing eksperimenter utført med forskjellig C. jejuni vill type belastninger og forskjellige IEC linjer i VDC-modellen med microaerobic forholdene i den apikale kupé reproduserbart resultere i en økning i antall samspill (nesten 10 ganger) og intracellulære (nesten 100 ganger) bakterier sammenlignet med aerobic kultur vilkår ^en. Miljøet opprettet i VDC modellen mer etterligner miljøet støtt av C. jejuni i den menneskelige tarmen og fremhever betydningen av å utføre in vitro infeksjon analyser under forhold som nærmere etterligne in vivo virkelighet. Vi foreslår at bruk av VDC modellen vil tillate nye tolkninger av interaksjoner satseWeen bakterielle patogener og vertscellene.

Introduction

Interaksjonene mellom bakterielle patogener med vertceller har blitt undersøkt grundig ved hjelp av in vitro cellekultur metoder. Ved hjelp av slike cellekulturer analyser, bakteriell vedheft til vertscellene, identifisering av verten celle reseptorer, vert celle signalveier og bakteriell invasjon av vertceller har alle blitt studert i detalj, noe som resulterer i mange viktige observasjoner. Men slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold som kanskje ikke er representative for in vivo miljø. En viktig begrensning av in vitro-modeller som brukes til å studere gastrointestinale infeksjoner er at kultur tilstander, inkludert høyt oksygennivå generelt favorisere eukaryote celle overlevelse. Men forholdene i den intestinale lumen vil være nesten anaerob. Enteriske patogener i et svært lite oksygen miljø uttrykke virulens gener som uttrykk endringer under aerobe forhold ^to. Som sådan, innhentet data ved hjelp av standard cellekultur modeller may gi en unøyaktig indikasjon av bakterielle interaksjon med vertsceller.

Campylobacter jejuni er den ledende utløsende agent for bakteriell akutt gastroenteritt på verdensbasis, med symptomer som spenner fra mild diaré til alvorlig inflammatorisk tarmbetennelse. Flertallet av C. jejuni infeksjoner resultat i ukomplisert gastroenteritt, men C. jejuni er også den mest identifisert smittestoff i perifere nevropatier, inkludert Guillain-Barré syndrom (GBS). I Storbritannia er det anslått at det finnes over 500.000 tilfeller av tarmbetennelse forårsaket av C. jejuni infeksjon hvert år med en anslått kostnad for den britiske økonomien på £ 580 millioner. I den tredje verden, C. jejuni er en ledende dødsårsak blant barn. Til tross for utvilsom betydningen av Campylobacter infeksjon og tiår med forskning, inkludert grundig genomikk-basert analyse, C. jejuni patogenesen er fortsatt dårlig understood, i motsetning til andre enteriske patogener som Salmonella, Escherichia coli, Shigella, og Vibrio cholerae. Mangelen på en praktisk liten dyremodell er en vesentlig årsak til dette ^tre. Også mye brukt in vitro infeksjon modeller er mer upassende for å studere microaerophilic C. jejuni enn for andre enteriske patogener som er fakultative anaerobe bakterier. Mens C. jejuni er anerkjent som en invasiv patogen, mekanismene for C. jejuni invasjonen av intestinal epitelceller (IECS) er fortsatt uklart ^4,5. C. jejuni invasjonen har vist seg å være avhengig av enten microfilaments, mikrotubuli, en kombinasjon av begge deler eller ingen av ^fem. Den forvirring i dette området er mest sannsynlig på grunn av bruk av upassende in vitro analysebetingelser.

En rekke forskjellige cellekultur-analyser er blitt brukt for å undersøke interaksjonen av C. jejunimed vertsceller. Caco-2 ^6, har INT 407 ^7, og T84 ⁸ cellelinjer alle blitt brukt til å studere vedheft og invasjon evner av forskjellig C. jejuni stammer. Nivåene av bakteriell adhesjon og invasjon for C. jejuni med IECS er dramatisk lavere enn for andre enteriske patogener ^ni. Den coculturing av C. jejuni med IECS er normalt utføres i en CO ₂ inkubator under forhold nær atmosfæriske oksygennivå, nødvendig for overlevelsen av IECS. C. jejuni genuttrykk vil være svært forskjellig i lav oksygen miljø av intestinal lumen sammenlignet med atmosfærisk oksygen forhold.

Bruken av en vertikal Diffusion kammer (VDC) system har blitt utviklet som tillater coculture av bakterier og vertsceller under forskjellige medium-og gass-forhold ^1,10,11. Dette systemet etterligner forholdene i tarmen der bakterier vil være under forholdene svært lavt oksygeninnhold mens vev vil bli forsynt med oksygen fra blodet. Polarisert IEC monolag dyrket i spesielle 0,4 mikrometer filter ble plassert inn i en VDC skape en apikal-og basolateral kupé, som individuelt ble fylt med bakteriell kjøttkraft og celledyrkingsmedium henholdsvis (figur 1). Den VDC ble anbrakt i den variable atmosfæren inkubator inneholdende 85% N _2, 5% O _2, og 10% _CO2 ved 37 ° C, noe som tilsvarer optimale betingelser for C. jejuni. Den apikale kupé ble etterlatt åpen og utsatt for atmosfæren microaerobic innenfor den variable atmosfæren inkubator, mens den forseglede basolateral kammer ble tilført oksygen med konstant administrering av 5% CO _2/95% O ₂ gassblanding med et utløpsrør hindre akkumulering av trykk . Caco-2 celle overlevelse og monolag integritet under disse forholdene ble bekreftet ved å overvåke transepithelial electrical motstand (Teer) over monolaget løpet av 24 timer for å demonstrere overlevelse av Caco-2 cellemonoskiktet og fysisk separasjon av apikale og basolateral seksjoner under forhold med lavt oksygennivå i den apikale kupé. Den teer av monolag i VDCs opprettholdt i den variable atmosfæren inkubator (microaerobic forhold) og i en standard cellekultur CO ₂ inkubator (aerobe betingelser) viste ingen signifikante forskjeller, noe som indikerer integriteten av cellemonoskiktet under forskjellige atmosfæriske forhold ^1. Under microaerobic forhold, forble tett veikryss tilstede og jevnt fordelt mellom cellekantene med en occludin flekker mønster som ligner på cellene opprettholdes under aerobe forhold ^en.

Interaksjonene mellom C. jejuni med Caco-2 og T84 celler i VDC ble undersøkt ved å vurdere bakteriell interaksjon (heft og invasjon) og invasjon. To forskjellige C. jejuni vill-type Strains ble brukt ^en. C. jejuni 11168H er en hypermotile derivat av den opprinnelige sekvensen belastningen NCTC11168. Den 11168H belastningen viser mye høyere kolonisering nivåer i en chick kolonisering modell og er dermed ansett som en passende belastning å bruke for host-patogen interaksjonsstudier. 81-176 er et humant isolat, og er en av de mest invasive mye studert laboratoriestammer. C. jejuni isolatene ble lagt til den apikale kupé av en VDC både under microaerobic eller aerobic forhold. Vi observerte høyere priser for både samhandling og invasjonen ble registrert for C. jejuni i henhold microaerobic forhold ^en. Den økte C. jejuni interaksjoner var ikke på grunn av en økning i bakterielle nummer i microaerobic forhold ^en. Denne informasjonen støtter vår hypotese om at den lave oksygen miljø i apikale kupé av VDC forbedrer bakterier-vert interaksjoner og viser at de invasive egenskapene til C. jejuni er incrlettet under disse forholdene. Dette var den første rapporten om bruken av VDC-modell for å studere en invasiv bakteriell patogen og belyser betydningen av å utføre in vitro-analyser infeksjon under betingelser som nærmere etterligner in vivo-situasjon. Den VDC-modellen kan brukes til å studere host-patogen interaksjoner for mange forskjellige bakteriearter.

Protocol

En. Vekst av IEC monolayers på Special 0,4 mikrometer Filters Kultur Caco-2-celler i Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) føtalt kalveserum, 100 E / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 1% (v / v) ikke-essensielle aminosyrer i en standard vevkultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECS per 0,4 mikrometer filtrere og vokse til polarisering over 21 dager, endre media hver 2-3 dager. Mål Teer å bekrefte …

Representative Results

Coculturing eksperimenter utført med en C. jejuni vill-type belastning og IECS i VDC-modellen med microaerobic forhold i den apikale kupé har vist en økning i antall samspill (nesten 10 ganger) og intracellulære (nesten 100 ganger) bakterier sammenlignet med aerobic kultur forhold i en tid -avhengig måte en. Denne observasjonen var reproduserbar ved hjelp av to forskjellige C. jejuni villtype stammer (11168H og 81-176) og to forskjellige IEC linjer (Caco-2 og T84), fremhever gyldigheten…

Discussion

Bruken av in vitro cellekultur-metoder for å studere interaksjoner av bakterielle patogener med vertceller er en teknikk mye brukt i mange laboratorier. Men da slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold, disse in vitro-modeller kan ikke nøyaktig representere in vivo miljøet hvor vert-patogen interaksjoner finner sted. Den er mye brukt i vitro infeksjon modellene er spesielt upassende for å studere microaerophilic C. jejuni sammenlignet med andre enteriske pa…

Materials

Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72