وكشف عن المنظمة هيكل الخلية من خلايا سرطان الغازية في 3D
Summary
تقدم هذه المقالة طريقة لتسمية fluorescently الكولاجين التي يمكن استخدامها لمزيد من الإصلاح على حد سواء والتصوير الحي من الثقافات الخلية 3D. كما نقوم بتوفير بروتوكول الأمثل لتصور البروتينات هيكل الخلية الذاتية من الخلايا المستزرعة في بيئات 3D.
Abstract
وقد جرت العادة على دراسة الهجرة الخلية في ركائز 2D. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن هناك حاجة لدراسة الهجرة خلية في بيئات 3D أكثر ملاءمة، التي تشبه بشكل أفضل الأبعاد من العمليات الفسيولوجية في السؤال. الخلايا المهاجرة يمكن أن تختلف إلى حد كبير في التشكل، ووضع الهجرة اعتمادا على ما إذا كانت تتحرك على ركائز 2D أو 3D. ونظرا للصعوبات التقنية وعدم التوافق مع بروتوكولات معظم القياسية، التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفات 3D لا يزال من غير المألوف. توضح هذه المقالة الطرق لإعداد وتصوير 3D الثقافات الخلايا السرطانية، إما كخلايا مفردة أو الأجسام الشبه الكروية. باعتبارها الركيزة ECM المناسبة للهجرة الخلايا السرطانية، ونحن نستخدم nonpepsinized الفئران الكولاجين ذيل أنا بلمرة في درجة حرارة الغرفة وfluorescently المسمى لتسهيل التصور باستخدام المجاهر مبائر القياسية. ويشمل هذا العمل أيضا protocرأ لوضع العلامات مناعي 3D من الهيكل الخلوي الخلية الذاتية. استخدام هذه البروتوكولات ونحن نأمل أن تسهم في وصف أفضل من التركيب الجزيئي، التعريب، ومهام الهياكل الخلوية في 3D.
Introduction
مجال الهجرة الخلية وقد تحدوا في العلامة التجارية الجديدة في العالم الثالث الأبعاد. فمن بديهية لدراسة الهجرة الخلية في بيئة التي تمثل الأكثر تطابقا واحد الفسيولوجية، وبالتالي، ثلاثي الأبعاد (3D). ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، أجريت دراسات الهجرة الأكثر خلية تحليل حركة الخلية عبر ثنائية البعد (2D) ركائز صلبة، إما غير المعالجة أو المغلفة مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية المناسب (ECM).
الدراسات الأولى مخصصة لهجرة الخلية في ثلاث السياج الكولاجين الأبعاد أعود أكثر من 20 عاما 1-3. ومع ذلك، فقط على مدى السنوات ال 5 الماضية أصبح من الواضح أن الخلايا المهاجرة يمكن أن تختلف إلى حد كبير في التشكل، ووضع الهجرة اعتمادا على أبعاد من الركيزة. في 2D، وخلايا الاتصال فقط الركيزة مع سطحها البطني باستخدام الالتصاقات البؤرية، مما أدى إلى تشكيل نتوءات مسطحة عريضة (أقدام صفاحية) معجزءا لا يتجزأ من الإصبع تشبه نتوءات (أرجل كاذبة خيطية) في قدرتها الرائدة. هذه الهياكل، جنبا إلى جنب مع الألياف الإجهاد التي تربط الجبهة الخلية إلى الحافة، ويعتقد أن تكون حاسمة بالنسبة لحركة الخلية في 2D. في المصفوفات 3D، والخلايا عادة ما تكون أكثر ممدود، مع سطح الخلية بأكملها الاتصال ECM، مما تسبب تغييرات كبيرة في تشكيل وصلة وظيفية لكثير من هذه الهياكل. وعلى العكس، ملامح الخلوية الأخرى تكتسب أهمية في الهجرة 3D، مثل تشوه والهياكل النووية تشارك في إعادة عرض ECM 4.
على الرغم من هذه التغيرات المورفولوجية المعروفة، فضلا عن الاختلافات في طرق الهجرة 5-7، والتي يمكن أن تختلف تبعا لECM وأنواع الخلايا، التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفات 3D لا يزال غير عادية. العمل مع سميكة وكثيفة المصفوفات 3D يحمل الصعوبات الفنية، مثل التصوير المجهري عالية الدقة، وعدم التوافق مع معظم ستابروتوكولات ndard الأمثل للثقافات 2D، مثل وضع العلامات مناعي من البروتينات الذاتية. أيضا، لأن استخدام المصفوفات 3D هو نهج جديد نسبيا، والباحثين مازالوا يحققون أفضل الظروف لتشبه محددة في حالات الجسم الحي، مثل الهندسة المعمارية انسجة طبيعية من الأنسجة المختلفة أو أجهزة المنظمة ECM حول الورم. تناقضات في النتائج من قبل مجموعات مختلفة فيما يتعلق، على سبيل المثال، قد ولدت وسائط الخلايا السرطانية من الهجرة أو وجود الالتصاقات البؤرية، بعض الجدل 8. وهناك الكثير من الجهد فقد تم تخصيص مؤخرا للتوصل إلى توافق في الآراء من حيث ECM الكيميائية طبيعة وحجم المسام، وسمك الألياف، وتصلب المصفوفة. وتستخدم حاليا العديد من أنواع مختلفة من موبينيل 3D، تتفاوت من خلية إلى مصفوفات المستمدة matrigel المتاحة تجاريا، والكولاجين البقري pepsinized أنا، أو nonpepsinized ذيل فأر الكولاجين I. كل من هذه المصفوفات له خصائص فيزيائية وكيميائية محددة، ويحتاج المرء إلى العالقاتالشركة المصرية للاتصالات مصفوفة من خيار لعملية الفسيولوجية التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن حجم المسام وسماكة الألياف تعتمد على ظروف البلمرة، مثل الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة 9،10. يمكن الربط إلى والمسافة من ركائز صلبة مثل الزجاج، وأيضا تغيير خصائص المرونة في مصفوفة 10،11.
توضح هذه المقالة الطرق لإعداد وتصوير 3D الثقافات الخلايا السرطانية، إما كخلايا مفردة أو الأجسام الشبه الكروية. وقد سبق وصف طرق لجعل الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية، وأكثرها شعبية يجري عملية الشنق قطرة أسلوب 12،13 وطريقة لوحة الاغاروز المغلفة 14. باعتبارها الركيزة ECM المناسبة للهجرة الخلايا السرطانية، ويستخدم nonpepsinized الفئران الكولاجين ذيل أنا بلمرة في درجة حرارة الغرفة في 2 ملغ / مل. Nonpepsinized الكولاجين حمض المستخرج أنا من ذيل الفئران يحتفظ كل من N-C ومحطة telopeptides، أجزاء nonhelical للجزيء الكولاجين المسؤولة عن الأم الكولاجين intermolecيشابك جزيئية والاستقرار fibrilar 15. معا، وهذه الظروف تسمح بتشكيل شبكات الكولاجين التي تشبه أوثق تلك التي لوحظت في الجسم الحي 10. للسماح التصور من ألياف الكولاجين، سواء في الثقافات الثابتة والمعيشة، ويتم توفير بروتوكول مفصلة لتسمية fluorescently الكولاجين في المختبر باستخدام 10 5 – (و-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)، succinimidyl استر. وقد تم تكييف هذا البروتوكول من Baici وآخرون. 16،17، حيث يتم استخدام فلوريسئين ثيوسيانات لتسمية جزيئات الكولاجين القابل للذوبان. كما فلوريسئين، TAMRA هو صبغة الفلورسنت الأمينية المتفاعل أن يتفاعل مع nonprotonated الأليفاتية المجموعات الأمينية للبروتينات، مثل مجموعة الأمينية الحرة في N-محطة، والأهم، والمجموعة الأمينية من الجانب lysines. رد الفعل هذا لا يحدث إلا في درجة الحموضة الأساسية، عندما يكون للمجموعة الأمينية ليسين في شكل nonprotonated. بالإضافة إلى TAMRA كونها أكثر استقرارا من خلال فلوريسئينالوقت، أطياف الانبعاثات ليسقط على نطاق برتقالي / أحمر (م ت / م = 555/518 نانومتر)، والتي يمكن دمجها بشكل مفيد لتصوير الخلايا الحية من البروتينات GFP الموسومة. باستخدام الكولاجين للذوبان جزيئات المسمى مع الأصباغ الأمينية التفاعل لا يؤثر على عملية البلمرة ولا كثافة، حجم المسام وحالة يشابك من المصفوفة الكولاجين 10،16،18،19.
ويشمل هذا البروتوكول أيضا وسيلة لوضع العلامات مناعي 3D من البروتينات الذاتية، التي تم تحسين أخرى لتسمية الهيكل الخلوي أو البروتينات المرتبطة الهيكل الخلوي. التركيز النهائي من هذا البروتوكول هو على طرق للحصول على الصور عالية الدقة من الثقافات 3D باستخدام المجهر متحد البؤر مع انخفاض مساهمة من coverslips الزجاج جامدة على التوتر مصفوفة الكولاجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا لتسمية fluorescently الكولاجين أنا باستخدام TAMRA يوفر وسيلة ممتازة للسماح التصور السهل للمنظمة شبكة الكولاجين، وذلك باستخدام المجهر متحد البؤر القياسية مجهزة ليزر نانومتر 561. ميزة هذه التقنية مقارنة مع الانعكاس متحد البؤر المجهري هو القدرة على صورة أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الامتنان الدكتور فاسيلي Gurchenkov (معهد كوري) لصورة اكتساب ومعالجة في الشكل 3 و مرفق التصوير PICT-IBISA (معهد كوري). وأيد هذا العمل من قبل ANR-09-JCJC0023-01، ARC SFI20111203863 والموافقة المسبقة عن علم 3D – مجمع في المختبر نماذج الخلوية.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
- Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
- Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
- Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
- Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
- Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
- Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
- Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
- Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
- Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
- Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
- Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).
