En strukturert protokoll er presentert for et cellebasert assay som en funksjonell test for å forutsi prognosen av idiopatisk skoliose ved hjelp av mobilnettet dielektrisk spektroskopi (CDS). Analysen kan bli utført med friske eller frosne perifere mononukleære blodceller (PBMC), og fremgangsmåten er fullført i løpet av 4 dager.
Denne protokollen beskriver eksperimentelle og analytiske prosedyre for et cellebasert assay utviklet i vårt laboratorium som en funksjonell test for å forutsi prognose av idiopatisk skoliose hos asymptomatiske og berørte barn. Analysen består av evalueringen av funksjonell status for GI og Gs proteiner i perifert blod mononukleære celler (PBMC) av cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS), ved hjelp av en automatisert CDS-basert instrument, og klassifiseringen av barna i tre funksjonelle grupper (FG1 , FG2, FG3) med hensyn til beskrivelsen av ubalanse mellom graden av respons til Gi-og Gs proteiner stimulering. Klassifiseringen er ytterligere bekreftet av differensial effekten av osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blant grupper og alvorlig progresjon av sykdommen er referert av FG2. Omtrent, blir et volum på 10 ml blod er nødvendig for å trekke ut PBMC ved Ficoll-gradient, og cellene blir deretter lagret i flytende nitrogen. Den tilstrekkelig antall PBMCs å utføre analysen oppnås etter to dager etter cellekultur. I hovedsak er celler første inkuberes med phytohemmaglutinin (PHA). Etter 24 timers inkubasjon blir mediet erstattet med et PHA fritt kulturmedium i ytterligere 24 timer før celle såing og OPN behandling. Cellene blir deretter spectroscopically screenet for deres svar på somatostatin og isoproterenol, som henholdsvis aktivere GI og Gs proteiner gjennom sine beslektede reseptorer. Både somatostatin og isoproterenol blir samtidig injisert med en integrert lufthåndtering system og cellenes respons blir overvåket i 15 min. Analysen kan utføres med friske eller frosne PBMC og prosedyren er fullført innen fire dager.
Idiopatisk skoliose er en ryggrad misdannelse av ukjent årsak generelt definert som en lateral krumning høyere enn 10 grader ledsaget av en ryggvirvel rotasjon en. Tilstanden rammer 4% av barnepopulasjonen, og er oftest diagnostisert i alderen 9 til 13 år 2,3,4. Diagnosen er hovedsakelig av utelukkelse og er laget kun etter utelukker andre årsaker til spinal misdannelse som ryggvirvel misdannelse, nevromuskulær eller syndromsykdommer. Tradisjonelt er det trunkal asymmetri avslørt av Adams frem bøying test og målt med scoliometer under fysisk undersøkelse fem. Diagnosen kan deretter bekreftes ved røntgen observasjon av kurven og vinkelmålingen ved hjelp av Cobb-metoden 6..
Når diagnosen, er den primære bekymring for leger i å håndtere scoliotic barn om kurven vil fremgang. Faktisk, er den kurve progresjon ofte uforutsigbare oger oftere observert blant jenter enn hos gutter 7. Hvis ubehandlet, kan kurven fremgang dramatisk, skaper betydelig fysisk deformitet og selv kardiopulmonære problemer. Disse manifestasjonene bli livstruende når kurven overstiger 70 ° 8,9. Den nåværende behandlingsalternativer for å hindre eller stanse kurve progresjon inkluderer oppkvikkende og kirurgi. Generelt er oppkvikkende anbefales for kurver mellom 25-40 °, mens kirurgi er reservert for kurver større enn 45 ° eller ikke svarer til avstiving.
Omtrent 10% av barn diagnostisert med idiopatisk skoliose har kurve progresjon krever korrigerende kirurgi 10. Det finnes for tiden ingen god metode eller test tilgjengelig for å identifisere denne kategori av pasienter. Følgelig er alle diagnostiserte barn utsatt for flere røntgenbilder over flere år, som regel før de når skjelett modenhet. Det er anslått at de typiske pasienter med skoliose fårca 22 radiologiske undersøkelser i løpet av en tre-års periode 11. På grunn av den potensielle risikoen for flere radiografiske undersøkelser, de alternative tilnærminger som kan tillate å utføre prognosen av idiopatisk skoliose uten å utsette barn for ioniserende stråling er sterkt ønskelig. Med den hensikt å møte dette behovet, har vi tidligere utviklet en cellebasert screening-analysen som en prognostisk test for å raskere identifisere de asymptomatiske barn med risiko for å utvikle idiopatisk skoliose. Testen spår den kliniske utfall i begge asymptomatiske og berørte barn ved å undersøke den funksjonelle statusen Gi proteiner og klassifisere barn inn i tre funksjonelle grupper (FG1, FG2 og FG3) i henhold til graden av maksimal respons på Gi protein stimulering 12 målt ved CDS basert system. Dette systemet er i stor grad brukt til å vurdere signaltransduksjon gjennom G proteiner i ulike celletyper 13,14,15,16. Det gir informasjon vedrørendetotal integrert respons av cellene til de ytre stimuli ved å måle endringer i impedansen som følge av aktivering av celleoverflatereseptorer. Celler blir utsådd i mikroplater som inneholder elektrodene på bunnen av brønnene og systemet anvender en liten spenning som induserer ekstracellulære og transcellular strømninger. Følgende forbindelse injeksjon i brønnen, er celleoverflate-reseptorer stimuleres og signaltransduksjon hendelser inntreffer, noe som fører til cellulære endringer som påvirker strømmen av ekstracellulære og transcellular strømmer, og derved påvirke den målte størrelse. Med denne tilnærmingen, scoliotic pasienter og barn mer utsatt for å utvikle skoliose er mindre mottakelig for Gi protein stimulering sammenlignet med friske kontrollpersoner, og klassifiseringen er basert på prosentandelen av grad av reduksjon i forhold til kontrollgruppen. De klassifiseringskjeder er festet mellom 10 og 40% for FG3, 40 og 60% for FG2, og 60 og 90% for FG1 12..
<p class = "jove_content"> Mer nylig har vi endret denne tilnærmingen ved å vise at de tre funksjonelle grupper kan tydelig skilles i henhold til profilen til ubalanse mellom respons på Gi og Gs stimulering. Ja, vi fant at respons på Gi stimulering dominerte i FG3, mens noen åpenbar ubalanse ble observert i FG2. I motsetning til dette oppviste FG1 overvekt for respons til Gs stimulering. I tillegg har vi gitt bevis for at pasienter som tilhører FG2 er mer utsatt for å utvikle til poenget med behov for kirurgi 17. Presisjonen av denne klassifiseringen testen har ytterligere blitt forbedret ved å demonstrere en differensial effekten av osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blant funksjonelle grupper.Her vi dokumentere detaljert fremgangsmåte av eksperimentelle og analytiske prosedyrer av denne funksjonstesten som i dag utføres i vårt laboratorium.
Vi har beskrevet en detaljert fremgangsmåte av en cellebasert prognostisk test for idiopatisk skoliose som gjelder for perifere mononukleære blodceller (PBMC) fersk isolert eller konservert frosset i opptil ett år i flytende nitrogen. Siden du bruker nylig isolerte PBMC er tungvint når testing stort antall individer, ble prosedyren presenteres med frosne PBMC som tilbyr en mer praktisk alternativ i klinisk setting. Men problemer med celle klumper ved tining ble påtruffet da frosne PBMC ble opprinnelig brukt, fører noen ganger til inter-assay variasjon. For å maksimere analysen reproduserbarhet, anbefaler vi unngår fryse-tine syklus og bruker den frosne prøven bare én gang. Fremgangsmåten er meget enkel, slik at for nøyaktig deteksjon av defekte Gi protein funksjon i løpet av kort tid. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, kan asymptomatiske og scoliotic barn lett bli klassifisert til å bedre forutsi deres kliniske utfall uten noen fare for deres helse. HoWever, når du utfører klassifisering i henhold til graden av maksimal respons på Gi stimulering i forhold til de friske kontrollpersoner 12, flere krav til kontrollpersoner bør være oppfylt. Faktisk, for å få en riktig sammenligning årsklasse, må kontrollpersoner være alder og kjønn matchet, ikke være på noen form for medisiner, og gi private opplysninger som tidligere individuelle / familiær sykehistorie. Disse kravene kan utgjøre et viktig hinder for rekruttering av kontrollpersoner. Derfor utfører klassifisering ved å undersøke graden av ubalanse mellom respons på Gi og Gs protein stimulering i samme individ er ideell for å eliminere nødvendigheten av å bruke kontrollpersoner.
Bruken av CDS-systemet til å utføre denne prognostisk test er betydelig i forhold til samtidig å gi Gi-og Gs-medierte cellulære responser i samme assay. Selv om mange pasienter kan klassifiseres uten ambiguity ved hjelp av det dynamiske området fast for denne analysen, vil et lite antall pasienter viser verdier ved grensen mot områder, som illustrert ved resultatene av den foreliggende rapport. Å diskriminere disse personene, har vi innført en evaluering av effekten av OPN på respons på Gi stimulering ved å demonstrere at OPN induserer en differensiell effekt på Gi-mediert cellulær respons blant de tre funksjonelle grupper. Ja, vi fant at i nærvær av OPN, respons på Gi stimulering økninger i FG1, mens det avtar i FG2 og FG3, til en høyere grad i FG2. Til tross for den høye kostnaden for OPN, er bruken av denne chemokine viktig å skille tvetydige tilfeller, og derfor forbedre nøyaktigheten av vår klassifiseringsanalyse. Imidlertid har denne analysen en ulempe i at et minimum på 1,5 x 10 5 celler per brønn er nødvendig for å observere cellulær respons med CDS-systemet i henhold til våre forsøksbetingelser. Prøvene visse pasient vil ikke ha et tilstrekkelig antallceller som skal testes. I dette tilfellet er det nødvendig å minne pasientene for ytterligere blodprøvetaking, noe som kan være bekymringsfullt for familier og frustrerende for medisinsk og laboratoriepersonalet. Prospektive studier er planlagt i vårt laboratorium for å løse dette problemet.
Ikke desto mindre, avhengig av gjeldende protokollen på enkle og velprøvde fremgangsmåter for å tilberede celler, mens testingen er automatisert ved bruk av et validert etikett-fritt system 13, 14 for å overvåke cellenes respons. Testingen plattformen er relativt billig sammenlignet med genetisk plattformen tilgjengelig for prognose av andre sykdommer. Også kostnadene for alle de engangsmateriell, inkludert blod samling rør, tips, den spesielle elektrode mikroplater, og konisk og Eppendorf-rør, er ikke veldig dyrt og er anslått til mindre enn $ 3000 for å fullføre en test for ca ett tusen pasienter. Selv om dette anslag ikke omfatter arbeidskostnader for fremstilling av prøverog utføre testen, forblir denne testen betydelig rimeligere enn neste generasjons sekvense plattformer. Verdt å merke seg, er ikke bare kostnadene sammenlignet genetiske plattformer, men mer spesifikt knyttet til feltet av AIS, er kostnadene knyttet til radiologisk bildebehandling. I dag er mer enn én million barn i USA og om lag 100.000 barn i Canada diagnostisert med idiopatisk skoliose, og den totale kostnaden for diagnostisering og monitorering av de scoliotic barn av X-ray eksponering er over 2,5 milliarder dollar årlig i Nord-Amerika. Dermed vil våre cellebasert assay fremgangsmåte forventes å være egnet for rutinemessig screening og overvåking av barn med idiopatisk skoliose uten helserisiko og til en lavere kostnad.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Frankrike (til Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (gi PP2-99466 til Dr. Moreau) og fra Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (Research tilskudd til Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |