Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması
Summary
Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.
Abstract
Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), kemik dokusunun hücre dışı matris içinde gömülü bir büyüme faktörüdür. Bu şekilde iyileşme ve de novo kemik oluşumunu stimüle osteoblastlar içine mezenkimal hücre farklılaşmasının tetikleyici olarak BMP-2 davranır. Iskeleleri ile birlikte rekombinant insan BMP-2 (rhBMP-2) klinik kullanımı sunum moduna göre, son tartışmalar yükseltti ve miktarı teslim edilecek. Burada sunulan protokol hücreler üzerinde in vitro çalışmalar için BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır. Bir heterobifonksiyonel bağlayıcının bir öz monte tek tabaka oluşturmak üzere nasıl tarif ve rhBMP-2 kovalent immobilizasyon elde etmek için daha sonraki bağlanma aşamasını göstermektedir. Bu yaklaşımla, bu proteinin biyolojik aktivitesini muhafaza ederken, BMP-2 sürekli bir sunum elde etmek mümkündür. Aslında, BMP-2 yüzey hareketsiz spesifik reklamlar önleyerek hedef inceleme sağlar:orption, büyüme faktörü miktarının azaltılması ve süre, en önemlisi de, yüzeyden kontrolsüz salınmasını engellemektedir. Hücreler, kovalent olarak hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 sunulması yüzeylere maruz kaldıkları zaman, BMP-2 tetiklediği hem kısa hem de uzun süreli sinyal olaylarının BMP-2 ile uyarılması, hücre tepkileri ile ilgili in vitro çalışmalar için bu yaklaşım uygun hale yer alıyor.
Introduction
Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), transforme edici büyüme faktörü (TGF-β) ailesi ve de novo kemik oluşumunun indükleyici hem de embriyonik gelişim ve yetişkin sırasında çeşitli dokuların düzenleyicisi olarak işlev görür 1-3 homeostasis bir üyesidir. Biyolojik olarak etkin olan homodimerik BMP-2 proteininin her bir monomer son derece tüm BMP 4 korunan bir "sistein düğüm" motifi içerir. Yedinci sistein iki monomer 5,6 arasında moleküller arası bir bağ oluşturan, dimerizasyon katılır ise yedi sistein kalıntılarının altı, her bir monomerin kararlı moleküller arası disülfid bağı oluşturur. Bu yüksek ölçüde korunmuş sistein düğüm BMP-2 proteininin üç boyutlu yapısını tanımlar ve bu ısı, denatüranlar ve asidik pH 7-9 karşı direnç gibi eşsiz özelliklerini belirler. BMP-2, böylece sinyal iletiminin uyarılması, serin / treonin kinaz zar reseptörlerine bağlanan <sup> 10-12. Reseptör oligomerizasyon moduna bağlı olarak, farklı bir sinyal yollar aktive edilir: a Smad-bağımlı yolu Smad karmaşık nükleer translokasyonu ve transkripsiyon aktivasyonu reseptör fosforilasyon ile aktif hale sonuçları ise bir Smad-bağımsız bir sinyal kaskadı, p38 aracılığı ile sinyalizasyon alkalin fosfataz, indüklenmesine yol açacaktır gibi farklılaşma inhibitörü (Id) 12-14 gibi belirli hedef genler,.
Kemik, BMP-2, böylece iyileşmesi ve kemik de novo oluşumunu teşvik edici, osteoblastlar içine mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasını indükler. Şu anda, rekombinant BMP-2 sitelerinin kırık iyileşmesini artırmak için klinik olarak uygulanır ifade edilmiştir. Kemik doku mühendisliğinde yaygın bir strateji, lokal verme sistemleri ile karşılaştırıldığında daha az invaziv bir enjekte edilebilir büyüme faktörleri, kullanılmasıdır. Bununla birlikte, in vivo çalışmalarda ve klinik uygulamalar göstermiştir ki, sahip olduğu kısa biyolojik yarı-ömür, spesifik olmayan locAdalet ve Hafıza ve BMP-2 hızlı lokal temizleme çeşitli lokal ve sistemik sorunlara ektopik 15 yol açabilir. Bu nedenle, etkili bir sunum, malzeme içinde veya üzerinde BMP-2'nin sürüklenmesini veya immobilizasyon elde etmek için, hedef bölgede, yerel ve sürekli uygulama için de gereklidir. Sürekli teslim gibi fiziksel olarak yakalanmalarında, adsorpsiyon ya da iyon kompleks 16 gibi kovalent olmayan bir tutma yaklaşımlar ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bilinen bu moleküllerin 17 denatürasyonda yüzeylerine proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon olabilir neden olur. Büyüme faktörlerinin bağlanması kovalent için, desteklerin farklı son on yıl içinde geliştirilmiştir. Örneğin, proteinin amino ya da karboksil grupları hedefleyen iki işlevli bağlama moleküllerinin kullanılması, zorunlu olarak hareketsiz hale elde etmek için protein modifikasyonu gerektirmeyen yaklaşımın bir türüdür. Aslında, ise protein modifikasyonu, protein yönünü kontrol etme avantajını sunmaktadıryapay etki, peptit etiketleri ve bölgeye özgü zincirlerinin giriş büyüme biyolojik aktivitesi 17 faktörleri değiştirebilir. Bu durumda, bağlı destek malzemesi ile etkileşim için denatürasyon aşmak için, yüzeyler istenilen faktörü 18 bağlanması ve ardından bir bağlayıcı molekülün bir kendi kendine monte tek tabaka (SAM) ile, örneğin, önceden işlevselleştirilebilir. Bu serbest amin kalıntıları hedefleyerek kovalent bir yüzey üzerine BMP-2 kılınması için bir SAM tabanlı bir yaklaşım kullandık ve hareketsizleştirilmiş protein kısa ve uzun süreli biyolojik aktiviteye 19 hem de muhafaza göstermiştir. Bu protokol, hücre membranında meydana gelir ve osteojenik sinyalizasyon sorumlu hücre içi sinyal düzenleyen mekanizmaları üzerinde in vitro çalışmalar için hücrelere BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, biyoaktif rhBMP-2 ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylerin hazırlanmasını tarif etmektedir. , RhBMP-2 protein 2) kovalent immobilizasyon altın yüzeyi üzerinde bir çift fonksiyonlu bağlayıcı, kendi kendine bir araya tek tabaka (SAM) 1) başlangıç sistemi: Bu yaklaşım, iki adım içermektedir. Önceki çalışmada, iki fonksiyonlu linker ile büyüme faktörü bağlayıcı etkili doğrulanmış ve yüzey hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 biyolojik aktivitesini muhafaza 19 olduğ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onun tür destek için Prof JP Spatz (Biyofizik Kimya Bölümü, Heidelberg Üniversitesi ve Yeni Malzemeler Biyosistem Bölümü, Akıllı Sistemler Max Planck Enstitüsü, Stuttgart) teşekkür ederim. Max-Planck-Gesellschaft ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (EAC-A DFG SFB/TR79.) Gelen mali destek de büyük ölçüde kabul edilmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D’Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors – the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
