Voksende neurale stamceller fra konventionelle og ikke-konventionelle regioner Adult gnaverhjerne

Summary

Neurale stamceller høstet fra den voksne hjerne er stigende udnyttes i ansøgninger fra den grundlæggende forskning af nervesystemet udvikling til at udforske potentielle kliniske applikationer i regenerativ medicin. Dette gør streng kontrol i isolerings-og anvendte dyrkningsbetingelser at dyrke disse celler kritisk at lyde eksperimentelle resultater.

Abstract

Nyligt arbejde viser, at det centrale nervesystem (CNS) regenerering og tumorigenesis indebærer populationer af stamceller (SCS) er hjemmehørende i den voksne hjerne. Men mekanismerne disse normalt hvilende celler anvender til at sikre et velfungerende neurale netværk, samt deres rolle i nyttiggørelse fra skade og afbødning af neurodegenerative processer er lidt forstået. Disse celler er bosat i områder, der er nævnt som "nicher", som giver et bærende miljø involverer modulatoriske signaler fra både vaskulære og immunforsvar. Isoleringen, vedligeholdelse og differentiering af CNS SCs under definerede dyrkningsbetingelser, der udelukker ukendte faktorer, der gør dem tilgængelige for behandling med farmakologiske eller genetiske midler, hvilket giver indsigt i deres in vivo adfærd. Her tilbyder vi detaljerede oplysninger om de metoder til at generere kulturer af CNS SCs fra forskellige regioner af den voksne hjerne og tilgange til at vurdere deres differentiation potentiale i neuroner, astrocytter og oligodendrocytter in vitro. Denne teknik giver en homogen cellepopulation som et monolag kultur, der kan visualiseres for at studere individuelle SCS og deres afkom. Desuden kan den anvendes på forskellige dyremodelsystemer og kliniske prøver, der tidligere har brugt til at forudsige regenerative respons i den beskadigede voksne nervesystem.

Introduction

Den centrale dogme om neurobiologi, fastsættes af de grundlæggende observationer af hjernen cytoarchitecture lavet af Ramón Y. Cajal over et århundrede siden, fastslog, at neurogenese var usandsynligt efter ungdomsårene i betragtning af kompleksiteten af de neurale netværk, der findes i CNS ^1.. På trods af arbejdet i Altman i 1960'erne, og senere Kaplan, som viser, at ³ H-thymidin kunne findes i modne neuroner, der angiver, at der faktisk neuroner blev genereret på forskellige områder af den voksne hjerne, dogmet fortsatte med at holde ^{2, 3.} Beviser fortsat voksede med Nottebohm forskning beskriver de sæsonbestemte ændringer i antallet af neuroner til stede i Songbird hjerner ^4. Det var ikke før 1999, hvor Gould et al. Publiceret arbejde på generation af neuroner i hippocampus stiger med udførelsen af associative indlæringsopgaver i rotter, samt observationer af Kornack og Rakic ​​demonstrationTing fortsatte neurogenese i den voksne makak, at begrebet en mindre stiv, mere plastisk hjerne, blev anerkendt ^{5, 6.}

Jagten på den cellulære kilde til disse de novo genereret neuroner fører til opdagelsen af en diskret population af stamceller (SCS), der er bosat i områder af hjernen kaldet nicher ^7. Den subventricular zone og sub granulære zone af hippocampus anses for at være de to vigtigste neurogene områder ^8,9. Celler isoleret fra disse placeringer vise den klassiske karakteristisk for embryonale eller føtale afledte SCS selvfornyelse og differentiering potentiale. I tilfælde af neurale stamceller (NSC), kan de differentieres til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Desuden er disse SCS farvet positive for føtale NSC markører, såsom den mellemliggende filamentprotein nestin ^10. Nyere arbejde understreger, at SCS ikke kan være begrænset til disse two områder og er faktisk lokaliseret i hele hjernen som en stort set hvilende population af celler tæt forbundet med vaskulaturen ^11.

Observationerne, der SCs mobiliseres i reaktion på skade antyder muligheden for at være i stand til at udnytte disse celler for regenerativ formål at støtte i nyttiggørelse fra neurodegenerative lidelse og slagtilfælde ^{12, 13.} Dette er ikke i modsætning til den rolle, som mesenchymale stamceller (MSC'er) spiller i heling af bindevæv, som findes som perivaskulære celler, der har potentiale til at blive osteoblaster, chondrocyter og fedtceller ^14. Dog kan NSC ikke kan høstes på samme måde som MSC fra knoglemarv ved rutinemæssig aspiration og densitetsgradientcentrifugering teknikker og efterfølgende udnyttes i autologe cellebaserede behandlinger. Som en konsekvens, andre kilder til celler, såsom anvendelsen af ​​føtale NSC eller neuronale prækursorer afledt fra EMBryonic stamceller er blevet grundigt udforsket i dyresygdomme og skade modeller med varierende grader af succes ^15. Induceret pluripotente stamceller teknologier anvender somatiske cellekilder tilbyde en anden potentiel avenue for at producere terapeutisk nyttige cellebaserede behandlingsformer for en bred vifte af applikationer, overvinde den begrænsede tilgængelighed og etiske bekymringer vedrørende brugen af embryonale celler og fostervæv ^16. Imidlertid har klinisk oversættelse af disse fund vist sig at være en vanskelig opgave, som demonstreret i kampene i behandling af forskellige neurologiske tilstande med SC-baserede terapeutiske tilgange ^17,18, samt en snoet vej til myndighedernes godkendelse. Som en alternativ tilgang, kan indførelse af specifikke farmakologiske behandlinger modulere NSC-numre og lette inddrivelsen i modeller af Parkinsons sygdom og slagtilfælde ^19. Uanset strategi kunne være, at forstå, hvordan man effektivt manipulere disse cellerkræver et tilgængeligt in vitro-system.

Kulturer af NSC kan udføres enten som samlede kulturer, også kendt som neurosfærer, eller som et monolag ^8,20. Begge teknikker er blevet udbredt, giver mulighed for etablering af definerede dyrkningsbetingelser, dvs brug af epidermal vækstfaktor (EGF) eller basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) som en mitogen kilde, der leverer til udvidelse af multipotente forstadier. Mens neurosfæreceller kulturer kan være bedre egnet til at studere klonal formering evne af en isoleret celletype, er systemet blevet påvist, at en blandet population af celler under ekspansion ^21. Desuden lukkede struktur neurosfærer vanskeliggør farmakologisk manipulation af cellerne upraktisk, og fortolkning af den indflydelse, disse faktorer kan have kunne forvirres grund mikromiljø etableret i neurosfæren selv. Monolagskulturer, på den anden side, kan væreansat i high throughput skærme af småmolekylebiblioteker, hvilket giver et kraftfuldt værktøj til at udforske signaltransduktionsegenskaberne mekanismer, der regulerer SC vækst og differentiering og åbner mulighed for at opdage nye forbindelser, der specifikt retter denne celle population.

Som følge heraf, kan evnen til på reproducerbar generere kulturer af voksne NSC fra forskellige regioner af interesse i hjernen kan anvendes i et bredt spektrum af forsknings-applikationer, der spænder fra udviklingsmæssige undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) til at udforske hidtil ukendte regenerativ medicin tilgange . Protokollen præsenteres her viser, hvordan at dissekere og vurdere differentiering potentiale CNS SCS isoleret fra den voksne gnaver hjernen.

Protocol

Arbejdet klæber til erklæringen fra Helsinski og ARVO Animal erklæring. Dyrene blev brugt til væv indsamling og alle relevante metoder blev fulgt i henhold til vejledningen af ​​dyret facilitet på University of Dresden. Dyrene blev håndteret og husede i henhold til de tyske retningslinjer for brug og pleje af forsøgsdyr, og undersøgelsen blev godkendt af Landesdirektion Dresden. Kontakt din institutionens veterinær politik (IACUC eller andet board) med hensyn til passende dødshjælp metodologi. <p clas…

Representative Results

Identifikation af området af interesse, hvorfra man kan høste neurale stamceller er det kritiske første skridt og vil definere mængden af ​​tid, det tager at få en sammenflydende plade af celler. For eksempel SVZ er en klassisk neurogen område, og derfor har en højere relativ andel af neurale stamceller. Dog kan den teknik, der præsenteres her bruges med andre regioner ikke ofte anerkendt som en robust neurogen potentiale i voksenalderen. Ved anvendelsen af ​​denne protokol, brugte vi den forreste commis…

Discussion

Mange af de trin, der er afgørende for vellykket isolation, ekspansion og differentiering af neurale stamceller fra den voksne hjerne deles i fællesskab med standard vævskulturteknikker. Målet om at huske på, er, at NSC isoleret fra den voksne hjerne skal bevare så mange af deres in vivo egenskaber som muligt (figur 2J). Ofte en balance mellem nødvendig forsigtighed og passende hastighed skal blive ramt. Care med isolering af hjernen fra kraniet vil gøre identifikationen af ​​region…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit