성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

Summary

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

Abstract

최근 연구는 중추 신경계 (CNS) 재생 및 종양 줄기 세포의 인구 (SC에) 성인 뇌 내 거주자를 포함 것을 보여줍니다. 그러나 메커니즘이 정상적으로 정지 세포가 적절한 신경망의 기능뿐만 아니라, 신경 퇴행성 프로세스의 부상 및 완화 회복에 자신의 역할을 보장하기 위해 고용은 조금 이해된다. 이러한 세포는 혈관 및 면역 조절 성 시스템 모두로부터 신호들을 포함한 서스테인 환경을 제공 「틈새」이라고도 영역에 상주. 알 수없는 요인을 제외 정의 배양 조건에서 CNS의 SC와의 분리, 유지 보수 및 차별화, 따라서 자신의 생체 내 행동에 대한 통찰력을 제공하고, 약물 또는 유전자에 의한 치료에 액세스 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 성인 뇌의 특정 영역에서 CNS의 SC와의 문화를 생성하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공하고 자신의 개발을 평가하는 접근신경 세포, 성상 세포, 그리고 체외에서 희소 돌기 아교 세포에 ifferentiation 가능성. 이 기술은 개별 SC에 자신의 자손을 연구하기 위해 시각화 할 수있는 단일 층 문화로 균일 한 세포 인구를 산출한다. 게다가, 다른 동물 모델 시스템과 임상 샘플을 가로 질러인가 될 수 손상된 성인 신경계 재생 반응을 예측하기 이전에 사용된다.

Introduction

한 세기 이상 전에 라몬 Y.를 Cajal에 의해 뇌 cytoarchitecture의 기본 관찰에 의해 규정 신경 생물학의 중심 교리는, 사춘기가 CNS ^1에서 발견되는 신경 네트워크의 복잡성을 주어진 후 신경이 어려울 것을 가졌다. 1960 년대에 알트만의 작품, 그리고 나중에 카플란, ³ H-티미 딘이 실제로 뉴런은 성인 뇌의 서로 다른 영역에서 생성되고 있었다 나타내는 성숙한 신경 세포에서 발견 될 수 있다는 것을 입증에도 불구하고, 교리는 ^{2, 3을} 유지하는 것을 계속했다. 증거는 가수 두뇌 ^4에 존재하는 뉴런의 수의 계절적 변화를 설명 Nottebohm의 연구를 탑재하는 것을 계속했다. 그것은 1999 년까지되지 않았을 때 쥐의 연관 학습 과제의 성능뿐만 아니라 Kornack 및 Rakic ​​시연의 관측과 해마 증가 뉴런의 생성에 굴드 등. 출판 일딸랑 딸랑 소리는 덜 엄격한, 더 플라스틱 뇌의 개념이, ⁵ 인식 된 성인 짧은 꼬리 ^{원숭이, 6에} 신경을 계속했다.

이 새로이 생성 된 신경 세포의 세포 소스에 대한 검색은 ⁷ 벽감으로 불리는 뇌의 영역에있는 줄기 세포 (SC에)의 이산 인구의 발견으로 이어질. subventricular 영역과 해마의 하위 세부 영역은 두 가지 주요 신경성 지역 ^8,9로 간주됩니다. 이 위치에서 분리 된 세포는 고전적인 배아 또는 태아의 파생으로 SC의 특성,자가 재생과 분화 가능성을 표시합니다. 신경줄 기세포 (NSCs의)의 경우, 이들은 뉴런, 아스트로 사이트, 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 또한, 이러한 SCS는 이러한 중간 필라멘트 단백질 네 스틴 ¹⁰ 태아 NSC 마커에 대한 긍정적 인 얼룩. 최근의 작업은 SC에이 t에 한정되지 않을 수 있음을 강조지역 우와, 그리고이 사실에 단단히 혈관 ^(11)와 관련된 세포의 대부분 대기 인구로 뇌 전반에 걸쳐 현지화.

SC에가 부상에 응답 동원 관측은 신경 퇴행성 질환 및 뇌졸중 ^{(12, 13)에서} 복구를 돕기 위해 회생 용으로 이들 세포를 이용할 수 있다는 가능성을 시사한다. 따라서 골아 세포, 연골 세포 및 지방 세포 ^(14)가 될 가능성이있는 혈관 주위 세포로 발견되는 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 결합 조직의 치유에 재생하는 역할 달리 아니다. 그러나 NSCs의 일상적인 흡인 및 밀도 구배 원심 분리 기술에 의해 골수에서 중간 엽 줄기 세포와 동일하게하여 수확 할 수없고 이후자가 세포 기반 치료에 활용. 결과적으로, 그러한의 emb 유래 태아 NSCs의 또는 신경 전구체의 사용과 같은 셀의 다른 소스ryonic 줄기 세포가 광범위하게 성공 ^(15)의 학위를 변화와 동물의 질병과 부상의 모델을 탐구하고 있습니다. 체세포 소스를 이용하여 유도 만능 줄기 세포 기술은 제한된 가용성 및 배아 세포와 태아 조직 ^(16)의 사용에 대한 윤리적 문제를 극복하고, 응용 프로그램의 광범위한 치료에 유용 세포 기반 치료법을 생산하는 또 다른 잠재적 인 수단을 제공합니다. 그러나, 이러한 연구 결과의 임상 번역 ^{(17, 18)뿐만} 아니라, 규제 통관에 구불 구불 한 경로를 접근 SC 기반 치료와 함께 다양한 신경 학적 조건을 치료하는 투쟁에서와 같이, 어려운 작업이 될 입증되었습니다. 다른 방법으로, 특정 약물 치료의 도입은 NSC의 숫자를 조절하고 파킨슨 질환과 뇌졸중의 ¹⁹ 모델의 회복을 촉진 할 수있다. 전략은 효과적으로 이러한 세포를 조작하는 방법을 이해 할 수있는 어떤접근 체외 시스템이 필요합니다.

NSCs의의 문화는 neurosphere를로 알려진 집계 문화, 또는 단일 층 ^8,20로도 수행 할 수 있습니다. 두 기술은 널리 다 능성 전구 물질의 확장을 제공 정의 배양 조건, 유사 분열 물질 소스로 표피 성장 인자 (EGF) 또는 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF의)의 예 사용의 설립을 허용, 사용되어왔다. neurosphere 배양 고립 셀 분류 클론 번식 능력을 연구에 더 적합 할 수 있지만, 시스템 ^(21)은 팽창시 세포의 혼합 집단을 생성하는 것으로 나타났다. 또, neurosphere를의 밀폐 구조는 세포의 약리 조작 비실용적하게하고, 이러한 요인이있을 수 영향 해석 인해 neurosphere 자체 내에 설립 미시로 혼동 할 수있다. 단층 배양, 다른 한편으로는, 일 수있다SC의 성장과 분화를 조절하고 특히이 세포 집단을 대상으로 새로운 화합물을 발견 할 수있는 기회를 여는 신호 전달 메커니즘을 탐구 할 수있는 강력한 도구를 제공하고, 작은 분자 라이브러리의 높은 처리량 화면에 사용.

결과적으로, 재현성 뇌 그 상이한 영역에서 성인 NSCs의 배양을 생성하는 기능은 중추 신경계 (CNS)의 개발 연구로부터 신규 한 재생 의료 방법을 탐구에 이르는 연구 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다 . 여기에 제시된 프로토콜은 해부 성인 쥐의 뇌에서 분리 CNS의 SC와의 차별화의 잠재력을 평가하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 작품은 Helsinski의 선언과 ARVO 동물 정책을 준수합니다. 드레스덴 대학의 동물 시설의 지침에 따라 동물 조직 수집에 사용 된 모든 관련 방법은 미행했다. 동물은 취급 및 보관 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 독일 연방 지침에 따라, 그리고 연구는 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인되었습니다했다. 적절한 안락사 방법에 대한 교육 기관의 동물 정책 (IACUC 또는 다른 보드)에 문의하십시오. <p…

Representative Results

신경 줄기 세포를 수확되는 관심 영역을 확인하는 것은 중요한 첫 단계이며 그것은 세포의 합류 판을 얻​​는 데 걸리는 시간의 양을 정의 할 것이다. 예를 들어, SVZ는 고전 신경성 영역이며, 따라서 신경 줄기 세포의 상대적으로 높은 비율을 갖는다. 그러나, 여기에 제시된 기술은 종종 성인기 강력한 신경성 잠재력을 갖는 것으로 인식되지 않는 다른 영역으로 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목?…

Discussion

성공적으로 분리, 확장, 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포의 분화에 중요한 단계의 대부분은 표준 조직 배양 기술에 공통으로 공유됩니다. 명심하는 목적은 성인의 뇌에서 분리 NSCs의 가능한 자신의 생체 내 특성 (그림 2,1)만큼을 유지해야한다는 것입니다. 종종 필요한주의와 적절한 속도 사이에 균형을 공격해야합니다. 두개골에서 뇌의 분리와 관심은 관심 영역의 식별이 훨씬 ?…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit