Den organotypiske hjernesnit cokultur med carcinomaceller muliggør visualisering morfologiske ændringer ved fluorescens samt lysfelt (video) mikroskopi under processen carcinomacellelinie invasion af hjernevæv. Dette modelsystem også mulighed for celle udvekslings-og genopfyldning metoder og byder på en bred vifte af manipulationer og analyser.
Patienter med cerebral metastase af carcinomer har en dårlig prognose. Imidlertid har processen på den metastatiske stedet knapt blevet undersøgt, især rolle beboeren (stroma) celler. Studier i primære carcinomer påvise indflydelsen af mikromiljøet på metastaser, selv på prognosen 1,2. Især tumorassocierede makrofager (TAM) støtte migration, invasion og spredning 3.. Interessant, store målsteder af metastase besidder vævsspecifikke makrofager, såsom Kupffer-celler i leveren eller mikroglia i centralnervesystemet. Desuden metastatiske steder også besidder andre vævsspecifikke celler, ligesom astrocytter. For nylig blev astrocytter påvist at fremme spredning og persistens af kræftceller 4,5. Derfor funktioner af disse vævsspecifikke celletyper synes at være meget vigtig i processen af hjernemetastaser 6,7.
På trods af disse observationer,Men indtil nu er der in vivo / in vitro-model tilgængelig ingen egnet til direkte at visualisere gliaceller reaktioner under cerebral metastase dannelse, især ved lysfeltmikroskopi. Seneste in vivo billeddannelse af carcinomaceller vist deres cerebral kolonisering adfærd 8.. Men denne metode er meget arbejdskrævende, kostbare og teknisk kompleks. Desuden er disse former for dyreforsøg begrænses til små serier og komme med en betydelig belastning for dyrene (ved implantation af glaspladen, injektion af tumorceller, gentagne anæstesi og langsigtet fiksering). Desuden er in vivo-billeddannelse hidtil begrænset til visualisering af carcinomaceller, mens interaktion med residente celler er endnu ikke blevet illustreret. Endelig er umulige 8 undersøgelser af humane carcinom celler i immunkompetente dyr.
Af disse grunde har vi etableret et cokultur-system consibrodden af en organotypisk mus hjerne skive og epitelceller indlejret i matrigel (3D celle sfære). 3D carcinomcellelinjer sfærer blev placeret direkte ved siden af hjernesnit kant med henblik på at undersøge, invasion af tilstødende hjernevæv. Det giver os mulighed for at visualisere morfologiske ændringer og samspillet mellem de gliaceller og carcinom celler ved fluorescens og endda af lysfeltmikroskopi. Efter cokultur eksperimentet kan hjernevævet eller 3D celle sfæroiderne blive indsamlet og anvendt til yderligere molekylære analyser (f.eks qRT-PCR, IHC eller immunoblot) samt til efterforskning med konfokal mikroskopi. Denne metode kan anvendes til at overvåge hændelser i en levende hjernevæv for dage uden skadelige virkninger på hjernen skiver. Modellen giver også selektiv undertrykkelse og udskiftning af residente celler af celler fra en donor væv til at bestemme særskilte konsekvenser af en given genotype. Endelig cokultur modellen er et praktisk alternativtil in vivo nærmer ved test målrettede farmakologiske manipulationer.
Tidligere histologiske undersøgelser af cerebral metastase demonstreret hurtige og drastiske ændringer af den residente gliaceller, især af astrocytter og microglia 13. At studere disse ændringer og interaktioner med carcinomacellerne, denne roman cokultur system er velegnet. Andre forskningsområder allerede har mangeårig erfaring med organotypiske hippocampus hjernen skiver. En fordel er, at de organotypiske hippocampus hjerne skivekulturer er levedygtige og effektivt bevaret for dage til uger, hvilket gør den velegnet til langsigtede eksperimenter. Da Stoppini introduktion af organotypiske hippocampus skive-system i 1991, er det blevet vidt anvendt, for eksempel i forskning af degenerative sygdomme. Således er denne innovere cokultur systemet repræsenterer en modifikation af en veletableret tilgang med en række applikationer i tumor biologi 9,11. Modifikationen tilbudt os en reproducerbar model til at vurdere karakteren af tumor invasion ofeftermonterede og dyrket ved grænsefladen fremgangsmåde er ideelt egnet til forsøg, der kræver en tredimensionel struktur. Adskillige teknikker er blevet anvendt til cokultur organotypiske hippocampus skiver med andre celler. Disse omfatter en indirekte system mellem makrofagceller og organotypisk hjerne skive 14 og en direkte cokultur af to forskellige snit fra hippocampus region 15. Glioma aggregater er også blevet samdyrket med hjerneskiver 16. Disse modeller kan anvendes til at analysere cellulære og molekylære begivenheder i hjernen skiver men ikke tillader direkte fysiologisk kontakt mellem tumorceller, mikroglia og hjerneparenchymet. Desuden er denne metode gør det muligt observation af mikroglia uden forurening af knoglemarv afledt perifere monocytter / makrofager. Anvendelsen af CCR2 og CX3CR1 transgene musemodel er en kritisk forbedring på grund af det faktum, at det er vanskeligt at skelne de bosiddende mikroglia fra invaderende monocytterbaseret på deres lignende egenskaber 17,18,19. Selvom intracerebral injektion af carcinomaceller tillader behandlende tumorudvikling, kan det ikke fortælle meget, om de er omgivet makrofag-lignende celler stammer fra hjerne-resident mikroglia population eller fra knoglemarv-afledte perifere monocytter / makrofager 17. Holdet af Kettenmann introduceret en organotypisk hjerne skive model, der er involveret pode gliomceller i hjernen skiver med en mikromanipulator 20. Men primære maligne gliomer er forskellige i mange henseender fra metastatiske karcinomer. Først maligne gliomer er af mesenchymal oprindelse, ikke metastaserer uden for nervesystemet og vandrer / invadere som enkeltceller uden grænsen mellem tumor og hjernevæv. Derimod infiltrativ vækst er en typisk patologisk karakteristik, og sådanne karcinom normalt migrere / invadere som kohorter. Anden carcinomer ofte forsøge at genopbygge epitel strukturer i hjernen, mens gliacellerforsøge at adskille svulsten fra hjernevæv med en (pseudo) kapsel. Overvejer biologiske og morfologiske træk, malignt gliom og metastasering af kræftsvulster er ikke rigtig sammenlignes. Af disse grunde har vi modificeret og udviklet et cokultur system, hvor vi ikke injicere men cokultur en carcinomacellelinie stik ved siden af hjernesnit. Desuden observerede vi microglial og astrocytisk ophobning ved grænsen af tumor stik, hvilket betyder, at mikroglia indtaste tumor stik og kan let afsløres ved lysfeltmikroskopi og bekræftet bagefter ved konfokal mikroskopi. Kræftcellerne invadere ind i hjernen skive, som kan sammenlignes med den virkelige in vivo situation og en konstatering af, Baumert og kolleger, der fandt en infiltration zone i 63% af obduktion sager med hjernemetastaser 21.
På grund af den manglende blodperfusion, der kun er bosiddende makrofager / mikroglia i denne kultur. Desuden, på grund af de mIssing T-celler, og derfor fraværende allo-reaktivitet, humane carcinomceller kan anvendes til cokultur selv med hjerneskiver i immunkompetente mus eller rotter (NMRI, B6 eller Wistar). Dette kunne tjene som et alternativ til den nøgen musemodel. Da der kan opnås 04:56 skiver fra hver mus er væsentligt reducerede antal dyr kræves i forhold til de eksisterende injektion modeller. Hertil kommer, at dyrene ikke lider for en lang periode med metastatisk sygdom, og de ikke undergår operative procedurer repetitively 22.
Med denne cokultur-systemet, har vi vist, at aktivering af mikroglia af kræftceller og kapacitet fremme cancercelleinvasion. Derudover er det første gang, at vores viden blev mikroglia fundet til aktivt at transportere carcinomceller 23.
Trods alle disse fordele det cokultur systemet har faktisk også begrænsninger. Det er stadig et in vitromodel mangler trinene metastase før kolonisering. På grund af mangel på perfusion, er det ikke muligt at undersøge ekstravasation. Således er den alternative måde at studere ekstravasation er at bruge enten in vivo injektion model eller den modificerede Boydenkammer-system med ekstracellulær matrix, HUVEC og astrocytter at efterligne blod-hjerne-barrieren 22,24. Hjernen skive cokultur metode er endnu en pålidelig og reproducerbar model med mange fordele og et potentiale for en bred vifte af applikationer, såsom analyse af kolonisering, især med fokus på den rolle, de bosiddende celler. Den kombination med andre etablerede teknikker (såsom immunhistokemi, konfokal mikroskopi og time-lapse mikroskopi) understøtter undersøgelse af direkte celle-til-celle interaktioner. Det er en nem alternativ og supplering af andre teknikker og giver adgang til den undersøgelse af stikord og effekter, som er pålagt af metastatisk mikromiljø.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Chalid Ghadban for hans fremragende teknisk assistance, Andreas Wodarz og Stephan Heermann for deres tekniske rådgivning vedrørende konfokal og time-lapse mikroskopi. Der er ingen interessekonflikt for nogen af forfatterne. Dette arbejde er finansieret af Forskningsrådet tysk (DFG) i Projekt 2 af Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), ved Dres. Bayer-Stiftung (Baden Wurttembergischer Krebspreis, Tyskland) og forskningsprogrammet for Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Georg-August-universitet i Göttingen, Tyskland.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |