Summary

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

Published: February 20, 2014
doi:

Summary

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

Abstract

בשנים האחרונות, שני פוטונים הדמיה הפכה לכלי רב ערך במדעי המוח, שכן היא מאפשרת למדידה כרונית של הפעילות של תאים מזוהים גנטי במהלך ההתנהגות 1-6. כאן אנו מתארים שיטות לבצע הדמיה שני פוטונים בקליפת מוח עכבר בעוד החיה מנווטת סביבת מציאות מדומה. אנו מתמקדים בהיבטים של הליכי הניסוי, כי הם מפתח להדמיה של בעלי חיים מתנהגים בסביבה וירטואלית מוארת. הבעיות המרכזיות המתעוררות בהתקנה ניסיונית זה שאנחנו כאן כתובת הם: מזעור ממצא תנועה קשורות במוח, צמצום דליפת אור ממערכת ההקרנה של מציאות מדומה, ומזעור נזק לרקמות לייזר מושרה. כמו כן אנו מספקים תוכנת מדגם כדי לשלוט בסביבת המציאות מדומה ולעשות מעקב תלמיד. עם הנהלים והמשאבים האלה זה צריך להיות אפשרי כדי להמיר מיקרוסקופ שני פוטונים קונבנציונליים לשימוש בהתנהגות עכברים.

Introduction

שני פוטונים הדמיה של מדדי סידן (מקודד גנטי כמו 7 GCaMP5 או R-Geco 8, או צבעים סינטטיים כמו OGB או Fluo4) התפתחה כשיטת רבת עוצמה של מדידת פעילות עצבית בהתנהגות עכברי 1-6. זה מאפשר מדידה בו זמנית של פעילותם של מאות תאים ברזולוציה פוטנציאל פעולה כמעט יחידה, עד כ 800 מיקרומטר מתחת לפני השטח המוח 9,10. יתר על כן, שימוש באינדיקטורים סידן מקודד גנטי (GECIs) פעילות עצבית ניתן למדוד באופן כרוני 5,11,12, ובסוגים מוגדרים מבחינה גנטית תא 13. יחד, שיטות אלה מספקים מידה מסוימת של רזולוציה של זמן ומרחב שנפתח שפע של אפשרויות חדשות בחקר החישוב העצבי in vivo.

התערבות כירורגית היא הכרחית כדי לחשוף ולתייג את מוח העכבר להדמיה. תאים בדרך כלל הם transfected באמצעות vir adeno הקשורים רקומביננטי לנו מערכת (AAV) למסירת Geci וחלון גולגולתי הוא מושתל על הזריקה כדי לקבל גישה אופטית למוח. בר ראש מחובר אז לגולגולת לקיבוע ראש מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים. התכנון והיישום של צעדים אלה הוא קריטיים כמו רוב הבעיות עם הדמיה ערה נובעים מחוסר היציבות בהכנה. באופן אידיאלי ההליך המתואר כאן צריך לאפשר הדמיה כרונית של עד מספר חודשים לאחר הניתוח.

כדי לאפשר התנהגות מודרכת חזותי במהלך ההדמיה שני פוטונים, העכבר הקבוע בראש יושב על הליכון כדורי אוויר נתמך, שבו ניתן להשתמש כדי לנווט בסביבת מציאות מדומה. תנועה של העכבר על ההליכון היא מצמידים את התנועה בסביבה הווירטואלית המוצגת על מסך טבעתי המקיף את 14,15 העכבר. ניתן להקליט משתנים התנהגותיים כגון תנועה, גירוי ויזואלי, ועמדת תלמיד 6.

t "> אנו מתארים את ההליכים כרוכים בהדמיה שני פוטונים כרוניות בעכברים לחקור את סביבת מציאות מדומה נקודות מפתח התייחסו הן:. הפחתה של חפצי תנועה, הפחתה של דליפת אור, מקסום מספר התאים נרשמו בו זמנית, ומזעור נזק תמונה. כמו כן אנו מספקים פרטים על הגדרת הליכון נתמך האוויר, מעקב אחר תלמיד, ואת סביבת המציאות מדומה. הנהלים שתוארו כאן יכולים לשמש להדמית אוכלוסיות תאים שכותרתו fluorescently בעכברים קבועים בראש במגוון רחב פוטנציאל של פרדיגמות התנהגותי .

Protocol

נהלי כל החיה אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות של מחלקת הווטרינרית של קנטון באזל. 1. התקנת חומרה ותוכנה התקנת הסריקה מיקרוסקופ שני פוטונים: <li style=";text-align:right;direction:rt…

Representative Results

איכות התמונה בהדמיה סידן שני פוטונים של אוכלוסיות תאים שכותרתו עם Geci תלוי במידה רבה באיכות של חלון השתל גולגולתי. שבועיים לאחר הזרקת וירוס החלון גולגולתי יש לבדוק לבהירות. לא צריך להיות שום רקמות פרור או (איור 1 א) הגלוי לצמיחה מחודשת עצם. יתר על כן, הדפוס של כ?…

Discussion

המפתח להצלחה של הדמיה שני פוטונים התנהגותיות הוא היציבות של התכשיר בשתי דרכים:

  1. במהלך ימים שלאחר השתלת חלון, תגובות דלקתיות של הרקמה יכולות להוביל לשיפור של היווצרות של רקמת פרור וסחוס שיפריע או אפילו למנוע הדמיה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרידריך מיישר המכון למחקר ביו, אגודת מקס פלאנק, והתכנית למדע הגבולות האנושי.

Materials

cover slips (d = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12kHz resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16x, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03  pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP  pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M  virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

References

  1. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
  2. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  3. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  4. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
  5. Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  6. Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
  7. Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  8. Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  9. Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
  10. Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
  11. Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
  13. Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  14. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  15. Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
  16. Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
  17. Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
  18. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
  19. Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
  20. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).

Play Video

Cite This Article
Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

View Video