Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais
Summary
A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.
Abstract
Homogeneização por espancamento talão é uma maneira rápida e eficiente para liberar DNA, RNA, proteínas e metabólitos de células de levedura de brotamento, que são notoriamente difíceis de romper. Aqui descrevemos o uso de um homogeneizador de moinho de esferas para a extracção de proteínas nos buffers optimizados para manter as funções, interações e modificações pós-traducionais das proteínas. As células em crescimento logarítmica que expressam a proteína de interesse é cultivada num meio de crescimento líquido de escolha. Os meios de cultura podem ser suplementados com os reagentes para induzir a expressão de proteína a partir de promotores inductíveis (por exemplo galactose), sincronizar estágio do ciclo celular (por exemplo, nocodazol), ou inibir a função do proteassoma (por exemplo, MG132). As células são então sedimentadas e ressuspensas num tampão adequado contendo a protease e / ou inibidores de fosfatase e seja processado imediatamente ou congelado em azoto líquido para posterior utilização. A homogeneização é realizada por seis ciclos de 20 seg bead-batimento (5,5 m / seg), cada um seguido por um minuto de incubação sobre gelo. O homogenato resultante foi clarificado por centrifugação e as pequenas partículas podem ser removidas por filtração. O extracto celular total foi afastada resultante (WCE) é precipitado utilizando 20% de TCA para análise directa de proteínas totais por SDS-PAGE seguido por Western blotting. Os extractos são também adequados para a purificação por afinidade de proteínas específicas, a detecção de modificações pós-tradução, ou a análise de proteínas de co-purificação. Como é o caso para a maioria dos protocolos de purificação de proteínas, algumas enzimas e proteínas podem exigir condições únicas ou composições de tampão para a sua purificação, e outros podem ser instáveis ou insolúveis sob as condições indicadas. Neste último caso, o protocolo apresentado pode proporcionar um ponto de partida útil para determinar empiricamente a melhor estratégia talão batimento para a extracção e purificação de proteínas. Mostramos a extração e purificação de um epitopo-marcado SUMO E3 ligase, Siz1, um ciclo celularregulada proteína que se torna tanto sumoylated e fosforilada, bem como uma subunidade de ubiquitina ligase SUMO-alvo, Slx5.
Introduction
O incrível poder de fermento genética é lendária, mas a preparação e análise de proteínas nativas da levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é muitas vezes repleta de problemas. O último é devido ao considerável resistência mecânica e elasticidade da parede da célula de levedura 1. Diferentes meios têm sido descritos para a ruptura das células de levedura para obter extracto de proteína de célula inteira 2-6 enzimática, química, mecânica e baseada pressão. Estas técnicas variam muito na sua eficácia para produzir extractos de proteínas nativas de células representativas, que podem ser utilizados para análises posteriores ou de passos de purificação. Por exemplo, a parede celular de levedura podem ser removidas com enzimas líticas (por exemplo, Zymolyase) e esferoblastos resultantes podem ser rompidas por cisalhamento, detergentes, ou lise osmótica para libertar proteínas. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso como o ponto de partida para muitos fraccionamentos subcelulares mas requer longas incubaçõesque não são compatíveis com a estabilidade de algumas proteínas 7.
Os reagentes de lise de levedura farmacêuticas (tais como detergentes) para a extracção química de proteínas de células de levedura estão disponíveis comercialmente, mas a eficácia destes reagentes na extracção da proteína e do seu efeito na subsequente caracterização bioquímica de proteínas não é sempre claro 8. Os homogeneizadores de alta pressão, muitas vezes referida como prensas Francesa, quebrar eficazmente células de levedura por primeiro submetendo-os a alta pressão e, em seguida, extrudindo-los através de uma pequena abertura de uma célula de pressão. Esta técnica produz extractos de elevada qualidade, mas o equipamento é muito caro e pode não ser adequado para pequenas quantidades de amostras de células ou múltiplos 9. Por conseguinte, a ruptura mecânica das células de levedura num moinho de esferas é frequentemente o método de escolha para a preparação de proteínas de levedura nativas 10. Esta técnica envolve a ruptura mecânica da parede celular da levedura com ácido-waverter esferas de vidro, que podem ser realizados com uma grande variedade de agitadores, moinhos de vortexers ou grânulo. Nomeadamente, este método pode ser usado para processar simultaneamente múltiplas amostras pequenas (1 ml de células ou menos). Muitas contas diferentes ou talão moinho matrizes rompimento já estão disponíveis comercialmente para interromper qualquer tipo de tipo de célula em tubos de 2 ml. Considerando as outras técnicas e equipamentos, um moinho de esferas tem a vantagem adicional de que a ruptura das células de levedura ocorre muito rapidamente, o que ajuda a preservar a modificações pós-translacionais, tais como sumoilação, especialmente quando são utilizados os tampões apropriados com protease e / ou inibidores de proteassoma e a temperatura é controlada de extractos.
Este protocolo centra-se na extração rápida, eficaz e confiável de proteínas endógenas e sobre-expressos em condições suaves com o objetivo final de preservar a função da proteína, interações e modificações pós-traducionais. O meio de crescimento, tampão de lise celularAs composições e configurações de moinho de esferas são optimizados para manter as interacções proteicas e modificações pós-traducionais tais como sumoilação e ubiquitinação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo centra-se na preparação de intacta, nativo, e as proteínas modificada após a tradução a partir de células de levedura de brotamento para aplicações a jusante. Antes de efectuar este protocolo, é crítico para determinar se a proteína de interesse pode ser facilmente detectado em extractos proteicos preparados sob condições de desnaturação 12. Se os anticorpos policlonais não estão disponíveis, pode ser vantajoso para epitopos marcação da proteína de interesse de modo a que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros do laboratório Kerscher pelo seu apoio. Agradecemos Mark Hochstrasser para o fermento tensão MHY3765. Este trabalho foi financiado pela NSF 1051970 (para OK) e um Howard Hughes Medical Institute Graduação viagem concessão e Monroe Scholars Programa Grant (para ES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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