Germogliamento lievito proteine estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali
Summary
La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l'analisi delle singole proteine o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali.
Abstract
Omogeneizzazione di battitura tallone è un modo veloce ed efficace per liberare il DNA, RNA, proteine e metaboliti da cellule di lievito in erba, che sono notoriamente difficile da interrompere. Qui si descrive l'uso di un mulino omogeneizzatore tallone per l'estrazione delle proteine nei buffer ottimizzati per mantenere le funzioni, interazioni e modificazioni post-traduzionali di proteine. Cellule in crescita logaritmica che esprimono la proteina di interesse sono coltivate in un mezzo di crescita liquide di scelta. I terreni di coltura possono essere completate con i reagenti per indurre l'espressione della proteina da promotori inducibili (ad esempio galattosio), sincronizzare fase del ciclo cellulare (ad es nocodazole), o inibire la funzione del proteasoma (es. MG132). Le cellule sono poi pellettato e risospese in un tampone adatto contenente proteasi e / o inibitori di fosfatasi e siano evase immediatamente o congelati in azoto liquido per uso successivo. Omogeneizzazione si ottiene sei cicli di 20 sec bead-battito (5,5 m / sec), ciascuno seguito di un minuto incubazione in ghiaccio. L'omogenato risultante è eliminato per centrifugazione e piccole particelle può essere rimosso per filtrazione. L'estratto cellulare e dovute eliminato (WCE) viene precipitato con 20% TCA per l'analisi diretta delle proteine totali mediante SDS-PAGE e Western blotting. Estratti sono adatti per affinità purificazione di proteine specifiche, la rilevazione di modificazioni post-traduzionali, o l'analisi delle proteine co-purificazione anche. Come è il caso per la maggior parte dei protocolli di purificazione delle proteine, alcuni enzimi e proteine possono richiedere condizioni uniche o composizioni tampone per la loro purificazione e altri possono essere instabili o insolubili nelle condizioni sopra indicate. In quest'ultimo caso, il protocollo presentato può fornire un punto di partenza utile per determinare empiricamente la migliore strategia tallone-battitura per estrazione e purificazione di proteine. Mostriamo l'estrazione e purificazione di un epitopo-tag SUMO E3 ligasi, SIZ1, un ciclo cellulareregolato proteina che diventa sia sumoylated e fosforilato, nonché un SUMO-mirata ubiquitina ligasi subunità, Slx5.
Introduction
L'incredibile potenza di lievito genetica è leggendaria, ma la preparazione e l'analisi delle proteine native di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, è spesso pieno di problemi. Quest'ultimo è dovuto al notevole resistenza meccanica e di elasticità della cellula di lievito parete 1. Mezzi diversi sono stati descritti per la enzimatica, chimiche, meccaniche, e la pressione a base di disgregazione di cellule di lievito avere estratto proteico cellula intera 2-6. Queste tecniche variano ampiamente nella loro efficacia di cedere, estratti di proteine native cellula-rappresentative che possono essere utilizzati per le successive analisi o fasi di purificazione. Ad esempio, la parete cellulare del lievito può essere rimosso con enzimi litici (es. zymolyase) e risultanti spheroblasts possono essere disturbate da taglio, detergenti, o lisi osmotica per rilasciare proteine. Questo approccio è stato impiegato con successo come punto di partenza per molte frazionamenti subcellulari ma richiede lunghe fasi di incubazioneche non sono compatibili con la stabilità di alcune proteine 7.
Reagenti di lisi del lievito di proprietà (come i detersivi) per l'estrazione chimica delle proteine di cellule di lievito sono disponibili in commercio, ma l'efficacia di questi reagenti in estrazione di proteine e il loro effetto sulla successiva caratterizzazione biochimica delle proteine non è sempre chiara 8. Omogeneizzatori ad alta pressione, spesso definito come presse francesi, effettivamente rompere le cellule di lievito per primo sottoponendoli ad alta pressione e poi l'estrusione attraverso una piccola apertura in una cella di pressione. Questa tecnica produce estratti di alta qualità, ma l'attrezzatura è molto costosa e può non essere adatto per piccole quantità di cellule o di campioni multipli 9. Pertanto, distruzione meccanica delle cellule di lievito in un mulino a sfere è spesso il metodo di scelta per native lievito preparazioni proteiche 10. Questa tecnica comporta distruzione meccanica della parete cellulare del lievito con acido-wagettare perle di vetro, che possono essere condotti con una varietà di agitatori, vortex o mulini tallone. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per elaborare simultaneamente più piccoli campioni (1 ml di cellule o meno). Molti perline diversi o perline mill matrici disagi sono ora disponibili in commercio per distruggere quasi ogni tipo di tipo di cellule in 2 ml provette. Considerando le altre tecniche ed apparecchiature, un mulino branello ha il vantaggio aggiunto che la rottura delle cellule di lievito verifica molto veloce, che aiuta a preservare modificazioni post-traduzionali, come sumoylation, specialmente quando i buffer appropriati con proteasi e / o inibitori del proteasoma sono utilizzati e la temperatura di estratti è controllata.
Questo protocollo si concentra sul veloce, efficace, affidabile e di estrazione di proteine endogene e over-espressa in condizioni di dolci con il fine ultimo di preservare la funzione delle proteine, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Mezzi di crescita, buffer di lisi cellularecomposizioni e le impostazioni mulino tallone sono ottimizzati per mantenere interazioni proteina e modificazioni post-traduzionali, come sumoylation e ubiquitylation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo si concentra sulla preparazione di intatto, nativo, e post-traduzionali modificato proteine da cellule di lievito in erba per le applicazioni a valle. Prima di tentare questo protocollo, è fondamentale per determinare se la proteina di interesse può essere facilmente rilevata in estratti proteici preparati in condizioni denaturanti 12. Se gli anticorpi policlonali non sono disponibili può essere vantaggioso per tag epitopo della proteina di interesse in modo che la proteina di fusio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri del Kerscher laboratorio per il loro sostegno. Ringraziamo Mark Hochstrasser per ceppo di lievito MHY3765. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere 1051970 (per OK) e un Howard Hughes Medical Institute di laurea concessione Viaggi e Monroe Scholars Program Grant (ad ES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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