Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties
Summary
De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.
Abstract
Homogenisatie door kraal slaan is een snelle en efficiënte manier om DNA, RNA, eiwitten, metabolieten en bevrijden van gist cellen, die notoir moeilijk te verstoren. Hier beschrijven we het gebruik van een parelmolen homogenisator voor de extractie van eiwitten in buffers geoptimaliseerd om de functies interacties en post-translationele modificaties van eiwitten behouden. Logaritmisch groeiende cellen die het eiwit van belang worden gekweekt in een vloeibaar kweekmedium van keuze. De groeimedia kan worden aangevuld met reagentia om eiwitexpressie te induceren van induceerbare promoters (bijv. galactose), synchroniseren celcyclus stadium (bv. nocodazole), of remmen proteasoomfunctie (bijv. MG132). De cellen worden vervolgens gepelleteerd en geresuspendeerd in een geschikte buffer die protease en / of fosfatase remmers en worden hetzij onmiddellijk verwerkt of bevroren in vloeibare stikstof voor later gebruik. Homogenisatie bewerkstelligd door zes cycli van 20 sec bead-beating (5,5 m / s), elk gevolgd door een minuut incubatie op ijs. Het resulterende homogenaat wordt geklaard door centrifugeren en kleine deeltjes kunnen worden verwijderd door filtratie. De resulterende gewist gehele celextracten (WCE) wordt geprecipiteerd met 20% TCA als directe analyse van alle eiwitten door SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Extracten zijn ook geschikt voor affiniteitszuivering van specifieke eiwitten, de detectie van post-translationele modificaties, of de analyse van medezuiverende eiwitten. Zoals het geval voor de meeste eiwitzuivering protocollen, kunnen sommige enzymen en eiwitten vereisen unieke omstandigheden of buffer samenstellingen voor hun zuivering en anderen instabiel of onoplosbaar genoemde voorwaarden zijn. In het laatste geval kan het protocol gepresenteerd een goed uitgangspunt verschaffen empirisch bepalen van de beste kraal-beating strategie voor eiwit-extractie en zuivering. We tonen de winning en zuivering van een epitoopgemerkte SUMO E3 ligase, Siz1, een celcyclusgereguleerd eiwit dat wordt zowel sumoylated en gefosforyleerd, en een SUMO-gerichte ubiquitine ligase subeenheid Slx5.
Introduction
De ontzagwekkende kracht van gistgenetica is legendarisch, maar de voorbereiding en analyse van de natieve eiwitten uit gist Saccharomyces cerevisiae, is vaak beladen met problemen. Dit laatste is het gevolg van de aanzienlijke mechanische sterkte en elasticiteit van de gistcelwand 1. Verschillende middelen zijn beschreven voor de enzymatische, chemische, mechanische en druk gebaseerde verstoring van gistcellen whole-cell-extract te verkrijgen 2-6. Deze technieken verschillen sterk in hun effectiviteit om cel-vertegenwoordiger, natieve proteïne extracten die kan worden gebruikt voor verdere analyses of zuiveringsstappen leveren. Bijvoorbeeld, kan de gist celwand met lytische enzymen (bijv. zymolyase) en resulterende spheroblasts verwijderd kan worden verstoord door afschuiving, detergenten of osmotische lysis om eiwitten vrij. Deze aanpak is met succes toegepast als het startpunt voor vele subcellulaire fractioneringen maar het vereist langdurige incubatiedie niet verenigbaar zijn met de stabiliteit van sommige eiwitten 7.
Proprietary gist lysis reagens (zoals detergenten) voor de chemische extractie van eiwitten van gistcellen in de handel verkrijgbaar, maar de doeltreffendheid van deze reagentia in eiwitextractie en hun effect op verdere biochemische karakterisatie van eiwitten is niet altijd duidelijk 8. Hoge druk homogenisatoren, vaak aangeduid als Franse persen, effectief te breken gistcellen door eerst te onderwerpen aan hoge druk en vervolgens extruderen ze via een kleine opening in een drukcel. Deze techniek produceert hoogwaardige extracten maar de apparatuur is erg duur en niet geschikt voor kleine hoeveelheden cellen of meerdere monsters 9. Daarom mechanische verbreking van gistcellen in een parelmolen is vaak de methode voor natieve gisteiwit preparaten 10. Deze techniek houdt mechanische verbreking van de gist celwand met zuur-waschuur glasparels, die kan worden uitgevoerd met diverse shakers, vortexers of parelmolens. Met name kan deze methode worden gebruikt om meerdere kleinere monsters (1 ml cellen of minder) tegelijkertijd verwerken. Veel verschillende kralen of parelmolen verstoring matrices zijn nu commercieel beschikbaar voor bijna elke vorm van celtype in 2 ml buizen verstoren. Gezien de andere technieken en apparatuur, een parelmolen heeft het voordeel dat verstoring van gistcellen komt zeer snel, wat helpt bij post-translationele modificaties zoals sumoylation behouden, vooral wanneer de geschikte buffers met protease en / of proteasome inhibitors worden gebruikt en de temperatuur van extracten wordt geregeld.
Dit protocol is gericht op de snelle, efficiënte en betrouwbare extractie van endogene en overexpressie gebrachte eiwitten onder milde omstandigheden met het uiteindelijke doel om eiwitfunctie, interacties, en post-translationele modificaties behouden. Groeimedia, cellysebuffersamenstellingen en parelmolen instellingen worden geoptimaliseerd eiwit interacties en post-translationele modificaties zoals sumoylation en ubiquitinering handhaven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gericht op de voorbereiding van intacte, inheemse, en post-translationeel gemodificeerde eiwitten uit gist cellen voor downstream-toepassingen. Voordat dit protocol, is het essentieel om te bepalen of het eiwit van belang gemakkelijk kan worden gedetecteerd in eiwitextracten bereid onder 12 denaturerende omstandigheden. Indien polyklonale antilichamen niet beschikbaar kan voordelig zijn om het epitoop tag eiwit van belang, zodat het fusie-eiwit kan worden gedetecteerd op Western blots. In het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle leden van de Kerscher lab voor hun steun. Wij danken Mark Hochstrasser voor giststam MHY3765. Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie 1051970 (op OK) en een Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reizen subsidie en Monroe Scholars Program Grant (naar ES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
