Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar
Summary
Framställningen av hög cellernas kvalitet jästextrakt är ett nödvändigt första steg i analysen av enskilda proteiner eller hela proteom. Här beskriver vi en snabb, effektiv och tillförlitlig homogenisering protokoll för spirande jästceller som har optimerats för att bevara proteinet fungerar, interaktioner och post-translationella modifieringar.
Abstract
Homogenisering av pärla stryk är ett snabbt och effektivt sätt att frigöra DNA, RNA, proteiner och metaboliter från knoppande jäst celler, som är notoriskt svåra att störa. Här beskriver vi användandet av en kulkvarn homogenisator för utvinning av proteiner i buffertar optimerade för att upprätthålla de funktioner, interaktioner och post-translationella modifieringar av proteiner. Logaritmiskt växande celler som uttrycker proteinet av intresse odlas i ett flytande odlingsmedium av valet. De tillväxtmedier kan kompletteras med reagens för att inducera proteinexpression från inducerbara promotorer (t.ex. galaktos), synkronisera steget cellcykeln (t.ex. nokodazol), eller inhiberar proteasomfunktion (t.ex. MG132). Cellerna pelleteras sedan och återsuspenderas i en lämplig buffert innehållande proteas och / eller hämmare fosfatas och är antingen bearbetas omedelbart eller frystes i flytande kväve för senare användning. Homogenisering åstadkommes genom sex cykler av 20 sek bead-stryk (5,5 m / s), var och en följd av en minuters inkubation på is. Det resulterande homogenatet rensas genom centrifugering och små partiklar kan avlägsnas genom filtrering. Den resulterande rensas helcellextrakt (WCE) fälls ut med 20% TCA för direkt analys av totala proteinerna genom SDS-PAGE följt av Western blotting. Extrakt är också lämpliga för affinitetsrening av specifika proteiner, detektion av post-translationella modifieringar, eller analys av co-rening av proteiner. Som är fallet för de flesta protokoll proteinreningstekniker kan vissa enzymer och proteiner kräver unika förhållanden eller kompositioner buffert för deras rening och andra kan vara instabil eller olöslig under angivna villkor. I det senare fallet kan det protokoll som presenteras ger en bra utgångspunkt för att empiriskt bestämma den bästa bead-stryk strategi för protein extraktion och rening. Vi visar extraktion och rening av en epitop-märkt SUMO E3-ligas, Siz1, en cellcykelreglerat protein som blir både sumoylated och phosphorylated, samt en SUMO-riktad ubiquitin ligas subenhet, Slx5.
Introduction
Den enorma kraften i jäst genetik är legendarisk, men förberedelserna och analysen av naturliga proteiner från knoppande jäst, Saccharomyces cerevisiae, är ofta förenat med problem. Det senare beror på att avsevärd mekanisk styrka och elasticitet av jästcellväggen 1. Följande sätt har beskrivits för den enzymatiska, kemiska, mekaniska, och tryck-baserade söndring av jästceller för att erhålla hel-cell proteinextrakt 2-6. Dessa tekniker varierar mycket i sin effektivitet för att ge cell-representativa, infödda proteinextrakten som kan användas för senare analyser eller reningssteg. Exempelvis kan jästcellväggen tas bort med lytiska enzymer (t.ex. zymolyas) och resulterande spheroblasts kan störas genom skjuvning, detergenter, eller osmotisk lys för att frigöra proteiner. Denna strategi har framgångsrikt använts som utgångspunkt för många subcellulära fraktioneringar men det kräver långa inkubationersom inte är förenliga med stabiliteten hos vissa proteiner 7.
Proprietary jäst lysisreagens (t.ex. rengöringsmedel) för kemisk extraktion av proteiner i jästceller finns kommersiellt tillgängliga, men effekten av dessa reagens i proteinextraktion och deras effekt på efterföljande biokemisk karakterisering av proteiner är inte alltid klart 8. Högtryckshomogenisatorer, ofta kallad franska pressar, bryter effektivt jästceller genom att först utsätta dem för högt tryck och sedan extrudering dem genom en liten öppning i en tryckcell. Denna teknik producerar högkvalitativa extrakt men utrustningen är mycket dyr och kanske inte passar för små mängder av celler eller flera prov 9. Därför är mekanisk sönderdelning av jästceller i en kulkvarn ofta metoden för inhemska preparat jästprotein 10. Denna teknik innebär mekanisk sönderdelning av jästcellväggen med syra-waskjul glaspärlor, vilket kan ske med en rad olika shakers, vortexers eller pärla kvarnar. Notably, kan denna metod användas för att samtidigt bearbeta flera mindre prover (1 ml celler eller mindre). Många olika pärlor eller kulkvam matriser störningar är nu kommersiellt tillgängliga att störa nästan alla typer av celltyp i 2 ml rör. Med tanke på de andra tekniker och utrustning, har en kulkvarn den ytterligare fördelen att söndringen av jästceller sker mycket snabbt, vilket bidrar till att bevara posttranslationella modifieringar såsom sumoylation, speciellt när tillämpliga buffertar med proteas och / eller proteasome inhibitors utnyttjas och temperaturen av extrakt styrs.
Detta protokoll är inriktat på den snabba, effektiva, och tillförlitlig extraktion av endogena och överuttryckt proteiner under försiktig betingelser med det slutliga målet att bevara proteiners funktion, interaktioner, och posttranslationella modifieringar. Tillväxtmedia, cell-lys buffertkompositioner och bead inställningar kvarn är optimerade för att upprätthålla proteininteraktioner och posttranslationella modifikationer såsom sumoylation och ubiquitylation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är inriktat på framställning av intakt, inföding, och posttranslationellt modifierade proteiner från spirande jästceller för nedströms applikationer. Innan du försöker detta protokoll, är det viktigt att avgöra om proteinet av intresse kan lätt upptäckas i protein extrakt framställda enligt denatureringsbetingelser 12. Om polyklonala antikroppar inte är tillgängliga kan det vara fördelaktigt att epitoppåhänget att proteinet av intresse så att fusionsproteinet kan detektera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar i Kerscher labbet för deras stöd. Vi tackar Mark Hochstrasser för Jäststammen MHY3765. Detta arbete stöddes av NSF bevilja 1051970 (till OK) och en Howard Hughes Medical Institute Grundutbildning Resebidrag och Monroe Scholars Program Grant (till ES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
