Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

Özet

Bu protokol, ökaryotik hücrelerde tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresinin kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek bu tekniğin doğruluğunu gösteriyoruz.

Özet

MALDI-TOF, kimya ve biyokimyada yaygın olarak kullanılan bir kütle spektrometresi tekniğidir. Tıpta molekülleri ve biyobelirteçleri tanımlamak için de uygulanmıştır. Son zamanlarda, mikrobiyolojide, klinik örneklerden yetiştirilen bakterilerin hazırlık veya fraksiyonlama adımları olmadan rutin olarak tanımlanması için kullanılmaktadır. Biz ve diğerleri, bu tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresi tekniğini ökaryotik hücrelere başarıyla uyguladık. Mevcut uygulamalar, hücre tipinin tanımlanmasından kalite kontrolüne, hücre kültürünün değerlendirilmesine ve teşhis uygulamalarına kadar uzanmaktadır. Burada, sitokinlere veya ısıyla öldürülen bakterilere yanıt olarak makrofajların çeşitli polarizasyon fenotiplerini keşfetmek için kullanımını açıklıyoruz. Makrofajların proteomik tepkilerinin çeşitliliğini temsil eden makrofaj spesifik parmak izlerinin tanımlanmasına izin verdi. Bu uygulama, yöntemin doğruluğunu ve basitliğini göstermektedir. Burada tarif ettiğimiz protokol, patolojik durumlarda immün konak yanıtını incelemek için yararlı olabilir veya daha geniş tanı uygulamalarına genişletilebilir.

Giriş

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS), biyolojik örnekleri incelemek için popüler bir kütle spektrometrisi tekniğidir. Bir lazer ışını ve enerji emici bir matris kullanmak, yumuşak bir iyonizasyon işlemine izin verir: büyük, çoğunlukla tek yüklü biyomoleküllerin buharlaşması ve oluşumu. Bu işleme desorpsiyon/iyonizasyon denir ve MALDI kısaltmasını haklı çıkarır. Bu iyonlar daha sonra voltaj uygulanarak hızlandırılır ve bu iyonların ayrılmasına ve ilgili kütlelerinin¹ miktarının belirlenmesine izin veren bir TOF analizörüne girer.

MALDI-TOF MS, biyoloji, kimya ve tıpta molekü....

Protokol

Mevcut protokolde, numunenin parmak izi olarak kabul edilen bir kütle spektrumu elde etmek için tam hücre MALDI-TOF tekniği kullanılmaktadır. Biyoinformatik bir analiz, bu parmak izlerinin karşılaştırılmasına ve sınıflandırılmasına izin verdi. Bu protokolde üç ana bölüm vardı:

1. Biyolojik örneklerin hazırlanması: farklı agonistlerle uyarılan makrofajları ve makrofajları kontrol edin.
2. Her bir numune tipinin teknik kopyalarla analizi, tam hücre MALDI-TOF MS ile tekrarlanır.
3. Ham verilerin biyoinformatik analizi.

Hücre izolasyonu ve kültürü için steril solüsyonlar hazırlayın. Tüm reaktifleri 4 °C'de hazırl....

Sonuçlar

Bu protokolün amacı, makrofajların mikroçevrelerine verdikleri yanıtı değerlendirmek için tüm hücre MALDI-TOF MS yönteminin doğruluğunu göstermektir.

Şekil 1, kan örneklerinden stimüle edilmiş makrofajların hazırlanmasını açıklamaktadır. Şekil 2, monositlerin ve MDM'lerin akış sitometrisi ile analizini temsil etmektedir. Monositlerin CD14 eksprese ettiği ancak CD68 eksprese etmediği görülmüştür (Şekil 1A). Aksine, MDM'ler CD68 eksprese etmiş a.......

Tartışma

Bu protokol, ökaryotik tam hücreler üzerinde MALDI-TOF-MS kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek yöntemin doğruluğunu gösteriyoruz.

Protokolün başarısı birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, herhangi bir çözelti kirleticisi spektrumları değiştirebilir. Örneğin, hedef üzerinde birikmeden önce kültür ortamını ve serum proteinlerini çıkarmak için PBS'deki hücreleri yıkamak önemlidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etm.......