На месте TEM биологических ассамблей в жидкости
Summary
Здесь мы описываем процедуру изображения вирусных комплексов в жидкости при разрешении нанометров с помощью электронного микроскопа передачи.
Abstract
Исследователи регулярно используют радиоэлектронные микроскопы (ТЭМ) для изучения биологических сущностей и оценки новых материалов. Здесь мы описываем дополнительное приложение для этих инструментов – просмотр вирусных сборок в жидкой среде. Этот захватывающий и новый метод визуализации биологических структур использует недавно разработанный микрофлюидный держатель образца. Наша видео статья демонстрирует, как собрать и использовать микрофлюидный держатель для изображения жидких образцов в TEM. В частности, в качестве нашей модельной системы мы используем симианские ротавирусные двухслойные частицы (DLPs). Мы также описываем шаги, чтобы покрыть поверхность жидкой камеры с сродством биопленок, которые привязывают DLPs к окну просмотра. Это позволяет нам изображения сборки таким образом, что подходит для определения 3D-структуры. Таким образом, мы представляем первый взгляд на подвирусные частицы в родной жидкой среде.
Introduction
Общей целью биологов и инженеров является понимание внутренней работы молекулярных машин. Передача Электронные микроскопы (ТЭМ) являются идеальными инструментами для визуализации этих сложных деталей при почти атомномразрешении 1-2. Для того, чтобы поддерживать высокую вакуумную систему TEM, биологические образцы, как правило, встроенные в тонкие пленки стекловидногольда 3,сахара 4, солитяжелых металлов 5, или некоторые комбинациииз них 6. В результате изображения встроенных образцов могут выявить лишь ограниченные снимки динамических процессов.
Ранние попытки сохранить биологические образцы гидратированных в экологических жидких камерах были предприняты Парсонс и его коллеги с использованием дифференциальных этапов перекачки. Электронные дифракционные узоры неоближенных кристаллов каталазы были успешно записаны с разрешением 3 евро в гидратированномсостоянии 7-8. Кроме того, фазополученные липидные области могут быть исследованы в гидратированных мембранахэритроцитов человека 9-10. Однако движение, вызванное распространением жидкости и ее вмешательством в электронный луч, привело к серьезной потере разрешения, и дальнейшие эксперименты с использованием биологических образцов не были предприняты до недавнего времени.
Недавно были введены недавно разработанные держатели микрофлюидных образцов, которые используют полупроводниковые микрочипы для формирования микро-масштабной экологической камеры. Эти устройства могут поддерживать образцы в жидкости, пока они расположены в столбцеTEM 11-12. Этот технический прорыв в визуализации TEM позволил исследователям впервые просмотреть прогрессивные события на молекулярном уровне13. Мы называем эту новую модальность«молекулярной микроскопией на месте», так как эксперименты теперь могут проводиться «внутри» столбца14-15. Общая цель этого метода заключается в изображении биологических сборок в жидкости для того, чтобы наблюдать их динамическое поведение при разрешении нанометра. Смысл разработанной методики заключается в том, чтобы записывать наблюдения в режиме реального времени и изучать новые свойства биологического механизма в растворе. Эта методология расширяет использование ТЭМ для более широких целей в клеточной и молекулярнойбиологии 12-16.
В текущей видео-статье мы представляем всеобъемлющий протокол для сборки и использования коммерчески доступного держателя микрофлюидных образцов. Эти специализированные держатели используют микрочипы кремния нитрида, произведенные с интегрированными проме сторонами, чтобы сформировать жидкую камеру, которая заключает мельчайшие объемы раствора. Тонкие прозрачные окна выгравированы в микрочипах для целей визуализации12. Мы демонстрируем правильное использование микрофлюидного держателя для изучения симиановых ротавирусных двухслойных частиц (DLPs) в жидкости с помощью TEM. Для обеспечения того, чтобы биологические сборки, такие как DLPs, не быстро рассеиваются на большие расстояния во время визуализации, мы используем подход Affinity Capture, чтобы привязать их к поверхности микрофлюиднойкамеры 16. Этот молекулярный шаг захвата имеет большое преимущество перед альтернативными методами для визуализации биологических образцов в жидкости, поскольку он позволяет приобретение изображений, которые будут использоваться для обработки вниз по течению процедур. Этот шаг захвата, используемый в сочетании с микрофлюидной визуализацией, уникален для нашихпроцедур 17. Читатели, использующие структурные биологические приложения с использованием TEM или микрофлюидных камер визуализации, могут рассмотреть вопрос об использовании методов сродства захвата, когда динамические наблюдения на молекулярном уровне являются конечной целью.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашей представленной работе мы использовали подход к захвату сродства, чтобы привязать ротавирусные DLPs к микрофлюидной платформе. Это позволило на месте изъястить макромолекулярные комплексы в жидкой микрооквидеоронии. Подход к захвату имеет важное значение по отношению к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают д-р Майкл J. Фридландер, директор Вирджинии Tech Carilion научно-исследовательский институт для поощрения наших научных усилий. Этот проект был поддержан фондами развития S.M.M и D.F.K., а также частично инициативой Nano-Bio Института критических технологий и прикладных наук в Virginia Tech.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
