In situ TEM för biologiska sammansättningar i vätska
Summary
Här beskriver vi en procedur för att avbilda virala komplex i vätska vid nanometerupplösning med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop.
Abstract
Forskare använder regelbundet Transmission Electron Microscopes (TEMs) för att undersöka biologiska enheter och för att bedöma nya material. Här beskriver vi ytterligare en applikation för dessa instrument – visning av virusenheter i en flytande miljö. Denna spännande och nya metod för att visualisera biologiska strukturer använder en nyligen utvecklad mikrofluidisk-baserad provhållare. Vår videoartikel visar hur man monterar och använder en mikrofluidisk hållare för att avbilda flytande exemplar inom en TEM. I synnerhet använder vi simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLPs) som vårt modellsystem. Vi beskriver också steg för att täcka ytan på vätskekammaren med affinitetsbiofilmer som tjudrar DLPs till visningsfönstret. Detta gör det möjligt för oss att avbilda sammansättningar på ett sätt som är lämpligt för 3D-strukturbestämning. Således presenterar vi en första glimt av subvirala partiklar i en inhemsk flytande miljö.
Introduction
Ett gemensamt mål för biologer och ingenjörer är att förstå molekylära maskiners inre arbete. Transmission Electron Microscopes (TEMs) är idealiska instrument för att visualisera dessa invecklade detaljer med nära atomupplösning1-2. För att upprätthålla det höga vakuumsystemet hos en TEM är biologiska prover vanligtvis inbäddade i tunna filmer av glaskroppsis3,sockerarter 4, tungmetallsalter5, eller någon kombination därav6. Som ett resultat kan bilder av inbäddade exemplar avslöja endast begränsade ögonblicksbilder av dynamiska processer.
Tidiga försök att upprätthålla biologiska exemplar hydratiserade i miljö flytande kammare genomfördes av Parsons och kollegor med hjälp av differentialpumpningssteg. Elektron diffraktion mönster av osedd katalas kristaller registrerades framgångsrikt till en upplösning av 3 Å i ett hydratiserat tillstånd7-8. Dessutom kunde fasavskilda lipiddomäner undersökas i hydratiserade membran av mänskliga erytrocyter9-10. Rörelse orsakad av diffus vätska och dess interferens med elektronstrålen resulterade dock i allvarlig upplösningsförlust och ytterligare experiment med biologiska prover försöktes inte förrän nyligen.
Nyutvecklade mikrofluidiska provhållare har introducerats som använder halvledarmikrochips för att bilda en mikroskalad miljökammare. Dessa anordningar kan hålla prover i vätska medan de placeras i en TEM-kolumn11-12. Detta tekniska genombrott inom TEM-avbildning har gjort det möjligt för forskare att för första gången se progressiva händelser på molekylär nivå13. Vi hänvisar till denna nya modalitet som “in situ molekylär mikroskopi ” eftersom experiment nu kan utföras “inuti”EM-kolumnen 14-15. Det övergripande målet med denna metod är att avbilda biologiska enheter i vätska för att observera deras dynamiska beteenden vid nanometerupplösning. Logiken bakom den utvecklade tekniken är att registrera realtidsobservationer och undersöka nya egenskaper hos biologiska maskiner i lösning. Denna metod utökar användningen av TEMs för bredare ändamål inom cellulär och molekylärbiologi12-16.
I den aktuella videoartikeln presenterar vi ett omfattande protokoll för att montera och använda en kommersiellt tillgänglig mikrofluidisk provhållare. Dessa specialiserade hållare använder kiselnitridmikrochips som produceras med integrerade distanser för att bilda en vätskekammare som omsluter minimala volymer lösning. Tunna, genomskinliga fönster etsas in i mikrochipsen för bildändamål12. Vi visar korrekt användning av en mikrofluidisk hållare för att undersöka simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLPs) i vätska med hjälp av en TEM. För att säkerställa att biologiska enheter, såsom DLPs, inte snabbt sprids över stora avstånd under avbildning, använder vi Affinity Capture-metoden för att binda dem till ytan av den mikrofluidiskakammaren 16. Detta molekylära fångststeg har en stor fördel jämfört med alternativa tekniker för avbildning av biologiska exemplar i vätska eftersom det möjliggör förvärv av bilder som kommer att användas för bearbetningsrutiner nedströms. Detta fångststeg som används tillsammans med mikrofluidisk avbildning är unikt för våra procedurer17. Läsare som använder strukturbiologiska applikationer med hjälp av TEM eller mikrofluidiska bildkammare kan överväga användningen av affinitetsfångsttekniker när dynamiska observationer på molekylär nivå är slutmålet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vårt presenterade arbete använde vi affinitetsfångstmetoden för att tjuder rotavirus DLPs till en mikrofluidisk plattform. Detta möjliggde in situ imaging av makromolekylära komplex i en flytande mikromiljö. Fångstmetoden är signifikant med avseende på andra mikrofluidiska avbildningstekniker eftersom den lokaliserar biologiska prover till bildfönstret för att förneka stora diffusiva problem som uppstår när man registrerar bilder i vätska. Ett av de mest kritiska stegen i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Dr. Michael J. Friedlander, chef för Virginia Tech Carilion Research Institute för att uppmuntra våra forskningsbesparare. Detta projekt stöddes av utvecklingsfonder till S.M.M och D.F.K. och delvis av Nano-Bio-initiativet från Institute for Critical Technology and Applied Science vid Virginia Tech.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
