Imagerie de protéines centrosomales pendant la spermatogenèse chez la drosophile est une méthode puissante pour identifier de nouvelles protéines essentielles pour la biologie centrosome ainsi que d'élucider la fonction particulière de joueurs connus dans ce processus.
Centrosomes sont conservées en fonction des organites microtubules dont la structure et le changement de façon spectaculaire au cours du cycle cellulaire et de la différenciation des cellules fonctionnelles. Centrosomes sont essentiels pour déterminer l'axe de division cellulaire au cours de la mitose et de la nucléation cils pendant l'interphase. L'identité des protéines qui interviennent dans ces changements dynamiques n'est que partiellement connue, et la fonction de la plupart des protéines qui ont été impliqués dans ces processus est encore rudimentaire. Des travaux récents ont montré que la drosophile spermatogenèse fournit un système puissant pour identifier de nouvelles protéines essentielles pour la fonction centrosome et la formation ainsi que de mieux comprendre la fonction particulière de joueurs connus dans les processus liés centrosome. Drosophile est un organisme modèle génétique établi où mutants gènes centrosomales peuvent être facilement obtenues et facilement analysés. En outre, les progrès récents dans la sensibilité et la résolution de la microscopie optique et ladéveloppement de marqueurs centrosomales génétiquement marqués robustes ont transformé la capacité d'utiliser des testicules chez la drosophile comme système modèle simple et accessible à étudier centrosomes. Cet article décrit l'utilisation de marqueurs centrosomales génétiquement marqués d'effectuer écrans génétiques pour les nouveaux mutants centrosomales et de mieux comprendre la fonction spécifique des gènes nouvellement identifiés.
Testicules chez la drosophile sont un système d'organe approprié pour étudier une variété de processus cellulaires et de développement et ont été examinés de manière détaillée au cours des années 1-9. Ce manuscrit porte sur l'utilisation des testicules chez la drosophile pour étudier le centrosome, un organite cellulaire conservée. Comme dans d'autres systèmes, le centrosome de la fonction testiculaire chez la drosophile dans la mitose, la méiose, et ciliogenèse 10. Centrosomes sont composés d'une paire de structures à base de microtubules appelés centrioles entourées par un réseau complexe de protéines en tant que matériau dénommé péricentriolaire (PCM). La paire centriole est constitué d'un centriole mère plus âgée et une fille plus jeune centriole. Comme la cellule progresse vers la mitose, les deux centrioles se séparent, en double, et d'acquérir une grande quantité de PCM pour former finalement deux centrosomes distinctes. Le centrosome contenant le centriole mère d'origine est appelée le centrosome mère et le centrosome contenant le centriole fille d'origine est désigné sous le nom de centrosome fille.
Testicules de Drosophila sont idéales pour étudier la base moléculaire de la biologie des centrosomes par microscopie à fluorescence pour une variété de raisons.
Ensemble, les caractéristiques ci-dessus mentionnées de Drosophila testicules fournit un modèle où le centrosome peut être étudié par imagerie facile, rapide et détaillée. Les techniques décritesdans le présent document ont été appliquées pour étudier de nombreux aspects de la biologie du centrosome y compris la formation centriole 11, la duplication centriole 15, le recrutement de PCM 16, la réglementation centrosome 17, et ciliogenèse 18. Ces techniques ont également été appliquées à l'étude du centrosome dans d'autres domaines de la biologie tels que la régulation de la méiose 19, ensemble de broche 20, et l'activité des centrosomes dans la division cellulaire asymétrique 21 souches parmi beaucoup d'autres.
Imagerie des testicules dans les mises en chantier centrosome avec l'obtention de mouches qui expriment des protéines centrosomales génétiquement marqués et isoler les testicules de larves mâle, nymphes, ou les mouches adultes. Ces mouches sont disponibles auprès de plusieurs groupes de recherche 1,11,15,22-25. Les testicules larvaires contiennent tous les stades de la spermatogenèse avant la méiose et sont utiles lors de l'analyse des mutations létales dans la nymphe ou adulte. Cependant, pupe tardive ou jeune adult testicules sont les plus robustes et contiennent tous les pré-et post-méiotiques étapes de la spermatogenèse, les rendant ainsi préférable pour l'analyse. Comme le nombre de spermatozoïdes diminue avec le vieillissement de la mouche, l'utilisation de testicules adultes est également approprié pour étudier le centrosome dans le contexte du vieillissement. 26. Procédé d'isolement de testicule de mouches adultes a été décrit précédemment 27.
Imagerie de centrosomes et leur fonction dans les testicules de Drosophila peut être réalisé par l'intermédiaire de trois pistes connexes qui sont présentés ici (figure 3). Sélection de piste qui est la plus appropriée dépend de la nature de la question le chercheur s'adresse.
Une piste implique l'imagerie des testicules en direct. Elle est la plus rapide des trois pistes, mais ne peut être appliquée lorsque les échantillons n'ont pas besoin d'être conservés et lorsque immunocoloration n'est pas nécessaire. En piste A, les testicules sont montés (intact, percé ou coupé) sur des lameset soigneusement écrasé sous une lamelle couvre-objet pour former une seule couche de cellules facilement identifiables. Les cellules sont ensuite visualisés en utilisant la microscopie à contraste de phase et par microscopie fluorescente. L'utilisation de contraste de phase est particulièrement important pour l'analyse des testicules Drosophila car elle révèle des informations cellulaire qui n'est pas visible par les autres formes d'éclairage par transmission et permet ainsi une identification rapide des divers stades de développement des spermatozoïdes 28,29. Cependant, la piste A présente deux inconvénients principaux. Tout d'abord, l'intégrité morphologique des cellules est souvent compromise lorsque les testicules sont rompues. Deuxièmement, les cellules non fixées se déplacent parfois dans l'échantillon, ce qui rend l'imagerie de multiples couches de confocale dans une région déterminée difficile. Pour promouvoir l'analyse des types de cellules spécifiques, les testicules peuvent être percés ou coupés afin d'orienter la manière dont les ruptures des testicules tels que l'écrasement sous le minimum de lamelle affecte la morphologie du type cellulaire d'intérêt.
Voie B implique la fixation chimique des testicules. Cette piste nécessite une quantité intermédiaire de temps pour la préparation des échantillons et a l'avantage que les spécimens fixes peuvent être enregistrées pour une analyse ultérieure. En outre, la fixation sert à fabriquer des structures cellulaires plus rigide, ce qui réduit le mouvement de l'échantillon lors de l'imagerie. Cependant, la microscopie à contraste de phase devient beaucoup moins informatif après fixation chimique, de faire quelques étapes du développement difficile d'identifier de sperme.
Volet C est la plupart du temps-intensive, mais a l'avantage supplémentaire que les structures cellulaires sont fixes et immunocolorées, permettant la visualisation des protéines qui ne sont pas disponibles avec les étiquettes génétiques appropriées. Il existe de nombreux anticorps disponibles à la fois commercialement et de divers groupes de recherche pour immunomarquage centrosomes et des structures liées centrosome dans les testicules chez la drosophile.
Étude de la biologie du centrosome dans les testicules de mouches en utilisant des marqueurs centrosomales génétiquement marqués est une méthode utile pour évaluer la fonction et l'activité centrosome à la fois un contexte de type sauvage et mutant. En particulier, la piste A est adapté pour le dépistage rapide des anomalies centrosomales tels que malformation, misegregation, l'instabilité, ou la longueur anormale dans un effort pour identifier de nouveaux mutants. En outre, spermatide cils dans des préparations vivantes restent immobiles pendant environ 15 min après la dissection et l'utilisation des testicules en direct en cours A permet également la motilité des spermatozoïdes pour être facile à régler. Etant donné que l'activité des spermatozoïdes motiles cils est directement liée à la fonction du centrosome, analyses peuvent être effectuées pour déterminer les effets de diverses mutations centrosomales sur la fonction ciliaire. Voie B peut être utilisé pour des observations plus spécifiques en particulier lorsque les données statistiques est nécessaire par exemple pour compter le nombre de cellules et par les centrioles ou le nombre de cellules par kyste. Volet C est le plus useful pour les observations détaillées qui nécessitent une coloration avec des anticorps. Des exemples comprennent l'étiquetage d'un type de cellule particulier, tel que des cellules souches, la coloration d'une protéine qui ne présente pas une étiquette disponible comme tubuline acétylée, ou de vérifier l'absence ou une mauvaise localisation d'une protéine dans un mutant.
Quand l'imagerie centrosomes et des structures liées centrosome, en utilisant des marqueurs génétiquement marqués plutôt que des anticorps est non seulement plus facile expérimentalement, mais fournit également des résultats plus robustes et reproductibles. Par conséquent, l'utilisation de protéines centrosomales génétiquement marqués est une approche fiable pour les analyses mécanistes et quantitatives qui nécessitent un grand nombre de données. Par exemple, l'utilisation de marqueurs centrosomales génétiquement marqués a été particulièrement utile pour la quantification de la longueur centriole. Cette analyse a révélé que diverses mutations peuvent être classés en deux catégories en fonction de la variabilité de la longueur centriole. Une catégorie comprend les mutations qui change longueur de centriole mais n'affectent pas l'écart type 1 et l'autre catégorie comprend les mutations qui affectent à la fois la longueur de centriole et l'écart-type de longueur 11. Ces données quantitatives peuvent fournir des indications utiles sur la fonction de certains gènes centrosomales. Mutants centrosomales qui présentent défectueux longueur de centriole avec une augmentation de l'écart-type peuvent être dues à une déstabilisation de la structure centriolaire. Cependant, défectueux longueur de centriole avec un écart type normal peut indiquer que la mutation ne déstabilise pas structurellement le centriole et est plus susceptible d'être dû à un changement de mécanisme de régulation contrôlant longueur centriole. A cause des incohérences dans immunomarquage, des analyses quantitatives sont difficiles avec l'utilisation de marqueurs d'anticorps seul.
Le centrosome est une grande structure protéique complexe, et plusieurs de ses protéines ne se trouvent dans son intérieur. Utilisation centrosomale génétiquement marquémarqueurs plutôt les anticorps permet un à étiqueter systématiquement les composants internes du centrosome dont épitopes peuvent être autrement inaccessibles aux anticorps marqueurs. Par exemple, des études de localisation de BLD10 utilisant des anticorps trouve la protéine à être enrichi au niveau des extrémités distales et proximales du centriole 13, tandis que BLD10-GFP montre une répartition plus uniforme 1. Cependant, il est également important de tenir compte du niveau d'expression d'une protéine génétiquement étiqueté particulier, comme cela peut affecter la distribution de la protéine. Localisation de Sas-4-GFP et SAS-6-GFP exprimé sous leur endogène est limitée aux extrémités proximales du centriole 1,16,35 D'autre part, Sas-4-GFP et SAS-6-GFP exprimé sous la fort promoteur de l'ubiquitine sont localisés le long de toute la longueur de la centriole 12,14. Une autre considération importante est l'effet de l'étiquette génétique sur la fonction des protéines. Analyser si des protéines génétiquement marqués sont fonctionnelles peut être tesTED en introduisant la protéine transgénique dans un fond mutant et d'examiner si la protéine transgénique sauve le phénotype mutant.
Fixation de testicules de Drosophila peut être réalisée en utilisant une variété de fixateurs chimiques. Ici, nous décrivons la fixation à la fois avec le formaldéhyde (Voie B) et de méthanol et d'acétone (Track C). Toutefois, soit le fixateur peut être utilisé de manière interchangeable et depuis différents fixateurs peuvent perturber chimiquement épitopes d'anticorps natifs, la sélection de la fixation appropriée pour une immunocoloration doit être déterminée expérimentalement. Les fixateurs suivants et les conditions d'incubation sont couramment employées: 3,7% de formaldehyde, 5 min à température ambiante; méthanol, 15 min à -20 ° C; acétone, 10 min à -20 ° C; méthanol, 15 min à -20 ° C. suivi par de l'acétone, 30 sec à -20 ° C; éthanol, 20 min à -20 ° C. Bien que la fixation à l'acétone, le méthanol, l'éthanol et ne nécessitent pas une étape de perméabilisation prolongée pour une immunocoloration, une fixation wie formaldéhyde doit être suivie d'une incubation de 1 h dans du PBST-B à la température ambiante, pour perméabiliser les membranes cellulaires et permettre l'accès aux épitopes d'anticorps intracellulaires. En outre, certains fixateurs sont plus appropriés pour des antigènes particuliers. Par exemple, les fonctions de formaldéhyde et pour la fixation des petites protéines, alors que le méthanol et l'acétone sont bien adaptés pour la fixation de grands complexes moléculaires 36.
Immunomarquage de Drosophila testicules a été décrit précédemment pour l'observation des structures de la chromatine et le cytosquelette microtubulaire 29,37. Ici (Track C), la procédure a été optimisé pour l'analyse des structures centrosomales contenant des protéines génétiquement marqués. Nous fournissons une description détaillée de cette procédure pour guider les personnes qui n'ont pas d'expérience de travail dans les testicules chez la drosophile. Cette procédure comprend également des modifications pour améliorer la conservation et la morphologie des testicules, par exemple en utilisant des siliconized lamelles et lames de microscope en verre chargés positivement.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par une subvention (R01GM098394) du NIH et l'Institut national des sciences médicales générales ainsi que la subvention de 1.121.176 National Science Foundation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |