Imaging av centrosomal proteiner under Drosophila spermatogenesen är en kraftfull metod för att identifiera nya proteiner kritiska för centro biologi samt att belysa den särskilda funktion av kända aktörer i denna process.
Centrosomes bevaras mikrotubuli-baserade organeller, vars struktur och funktionsförändringar dramatiskt under hela cellcykeln och celldifferentiering. Centrosomes är viktigt att bestämma celldelning axeln under mitos och att kärn cilier under interfas. Identiteten av de proteiner som medierar dessa dynamiska förändringar förblir endast delvis kända, och funktionen hos många av de proteiner som har varit inblandade i dessa processer är fortfarande rudimentära. Senaste arbete har visat att Drosophila spermatogenesen ger ett kraftfullt system för att identifiera nya proteiner kritiska för centro funktion och bildning samt att få insikt i den särskilda funktion av kända spelare i centrorelaterade processer. Drosophila är en etablerad genetisk modellorganism där mutanter i centrosomal gener kan lätt erhållas och enkelt analyseras. Vidare, de senaste framstegen inom den känslighet och upplösning av ljusmikroskop ochutveckling av robusta genetiskt taggade centrosomal markörer har förändrat möjligheten att använda Drosophila testiklar som ett enkelt och tillgängligt modellsystem för att studera centrosomes. Detta dokument beskriver användningen av genetiskt-taggade centrosomal markörer för att utföra genetiska skärmar för nya centrosomal mutanter och att få insikt i den specifika funktion av nyligen identifierade gener.
Drosophila testiklar är ett lämpligt organ för att studera en mängd olika cellulära och utvecklingsprocesser och har granskats mycket under åren 1-9. Detta manuskript fokuserar på användning av Drosophila testiklar att studera centro, en konserverad cellorganell. Som i andra system, centrosome av Drosophila testiklar funktion i mitos, meios och ciliogenesis 10. Centrosomes är sammansatta av ett par av mikrotubuli-baserade strukturer som kallas centrioler omgivna av ett komplext protein nätverk kallat pericentriolar material (PCM). Den centriole paret består av en äldre mor centriole och en yngre dotter centriole. Eftersom cellen fortskrider mot mitos, båda centrioler separat, duplicera, och skaffa en stor mängd PCM för att slutligen bilda två distinkta centrosomes. Den centro innehåller den ursprungliga moder centriole kallas modercentro och centrOsome innehåller den ursprungliga dottern centriole kallas dottern centro.
Drosophila testiklarna är idealiska för att studera den molekylära grunden för centro biologi genom fluorescensmikroskopi för en rad olika skäl.
Tillsammans, de ovan angivna egenskaperna hos Drosophila testiklar ger en modell där centro kan studeras genom enkel, snabb och detaljerad avbildning. De tekniker som beskrivsi denna uppsats har tillämpats för att undersöka många aspekter av centro biologi inklusive centriole formation 11, centriole dubbel 15, PCM rekrytering 16, centro reglering 17, och ciliogenesis 18. Dessa tekniker har också använts för att studera den centro i andra områden av biologin, t.ex. meiotisk reglering 19, spindelenheten 20, och centro aktivitet i asymmetrisk stamcells division 21 bland många andra.
Imaging av testiklarna i centro börjar med att få flugor som uttrycker genetiskt-märkta centrosomal proteiner och isolera testiklarna från manliga larver, puppor eller vuxna flugor. Dessa flugor är tillgängliga från flera forskargrupper 1,11,15,22-25. Larv Testiklarna innehåller alla stadier av spermatogenesen före meios och är användbara när man analyserar mutationer som är dödlig i puppa eller en vuxen. Men sen pupal eller unga adult testiklarna är den mest stabila och innehåller alla pre-och post-meiotiska stadier av spermatogenesen, vilket gör dem bättre för analys. Eftersom antalet sädesceller minskar när gylf åldrar, är också lämpligt för att studera den centro i samband med åldrande. 26 användningen av vuxen testiklarna. Förfarande för testikel isolering från vuxna flugor har tidigare beskrivits 27.
Imaging av centrosomes och deras funktion i Drosophila testiklar kan uppnås via tre relaterade låtar som presenteras här (Figur 3). Valet av vilket spår som är lämpligast är beroende på arten av den ifrågavarande undersökaren adressering.
Spår A involverar avbildning av levande testiklarna. Det är den snabbaste av de tre spår men kan endast användas när prover inte behöver bevaras och när immunfärgning krävs inte. I Spår A, är testiklar monterade (intakt, genomborrade eller klippa) på objektglasoch försiktigt kläm under ett täckglas för att bilda ett enda lager av lätt identifierbara celler. Cellerna sedan visualiseras med både faskontrastmikroskopi och fluorescensmikroskopi. Användningen av fas-kontrast är särskilt viktig för analys av Drosophila testiklar eftersom det avslöjar cellulär information som inte syns med andra former av överförd belysning och därmed möjliggör en snabb identifiering av olika stadier av spermieutvecklingen 28,29. Emellertid har Spår A två huvudsakliga nackdelar. För det första är den morfologiska integriteten för cellerna ofta äventyras när testiklarna brustit. För det andra, ofixerade celler rör sig ibland i provet, vilket gör att avbilda flera konfokala skikt inom ett specificerat område svårt. Att främja analyser av specifika celltyper, kan testiklarna genomborras eller skäras för att styra hur testiklarna brister såsom att krossa under täckglaset minimalt påverkar morfologin av celltypen av intresse.
Spår B innebär kemisk fixering av testiklarna. Detta spår kräver en mellanliggande tid för provberedning och har fördelen att fasta prover kan sparas för senare analys. Vidare tjänar fixering för att göra cellulära strukturer styvare, vilket minimerar rörelsen av provet under avbildning. Dock blir faskontrastmikroskopi mycket mindre informativ efter kemisk fixering, vilket gör vissa utvecklingsstadier svårt att identifiera spermier.
Spår C är den mest tidskrävande, men har fördelen att cellstrukturer är fasta och immun, vilket möjliggör visualisering av proteiner som inte är tillgängliga med rätt genetik taggar. Det finns många antikroppar som finns både kommersiellt och från olika forskargrupper för immunfärgning centrosomes och centrorelaterade strukturer i Drosophila testiklar.
Studera centro biologi i flyga testiklar som använder genetiskt etikette centrosomal markörer är en användbar metod för att bedöma centro funktion och aktivitet i både vildtyp och mutant sammanhang. I synnerhet är Spår A lämplig för snabb screening av centrosomal störningar såsom missbildning, misegregation, instabilitet, eller abnorm längd i ett försök att identifiera nya mutanter. Vidare spermatid cilier i levande preparat förblir rörliga i ungefär 15 min efter dissekering och användning av levande testiklar i Spår A möjliggör också för spermierörlighet för att lätt hanteras. Eftersom aktiviteten av spermier rörliga cilier är direkt relaterad till centro funktion, kan analyser göras för att bestämma effekterna av olika centrosomal mutationer på ciliär funktion. Spår B kan användas för flera observationer speciellt när statistiska uppgifter krävs till exempel för att räkna antalet centrioler per cell och eller antalet celler per cysta. Spår C är mest useful för detaljerade observationer som kräver färgning med antikroppar. Exempel innefattar märkning av en speciell celltyp, såsom stamceller, färgning av ett protein som inte har en tillgänglig tagg såsom acetylerad tubulin, eller för att kontrollera frånvaron eller mislocalization av ett protein i en mutant.
När avbildning centrosomes och centrorelaterade strukturer, att använda genetiskt märkta markörer snarare än antikroppar är inte bara experimentellt enklare, men ger också mer robusta och reproducerbara resultat. Därför är användningen av genetiskt-märkta centrosomal proteiner en tillförlitlig metod för mekanistiska och kvantitativa analyser som kräver en stor datamängd. Till exempel har användningen av genetiskt-etikette centrosomal markörer varit särskilt värdefull för kvantifiering av centriole längd. En sådan analys har visat att olika mutationer kan klassificeras i två kategorier baserat på variationen i centriole längd. En kategori innehåller mutationer som chanGE centriole längd men påverkar inte standardavvikelsen 1 och den andra kategorin omfattar mutationer som påverkar både centriole längd och standardavvikelsen i längd 11. Sådana kvantitativa data kan ge värdefull insikt i funktionen av vissa centrosomal gener. Centrosomal mutanter som uppvisar defekta centriole längd med ökad standardavvikelse kan bero på en destabilisering av centriolar struktur. Emellertid kan defekta centriole längd med en vanlig standardfelet indikerar att mutationen inte strukturellt inte destabiliserar centriole och är mer sannolikt att bero på en förändring i regleringsmekanism kontrollerar centriole längd. På grund av bristande överensstämmelse i immunofärgning, kvantitativa analyser är svåra med användning av markörer antikropp enbart.
Den centro är en stor, komplex proteinliknande struktur och många av dess proteiner bara finns inom dess inre. Användning av genetiskt märkta centrosomalmarkörer snarare antikropparna tillåter en att konsekvent märka inre komponenter centro vars epitoper kan vara på annat sätt otillgängligt för markörer antikroppar. Exempelvis lokaliseringsstudier av Bld10 användning av antikroppar finner det protein som skall anrikas på de distala och proximala ändarna av centriole 13, medan Bld10-GFP visar en mer likformig fördelning 1. Emellertid är det också viktigt att beakta graden av uttryck av en särskild genetiskt märkt protein, eftersom detta kan påverka fördelningen protein. Lokalisering av Sas-4-GFP-och SAS-6-GFP uttryckt under deras endogena är begränsad till de proximala ändarna av centriole 1,16,35 Å andra sidan, Sas-4-GFP-och SAS-6-GFP uttrycks under stark ubikitinpromotor är lokaliserade längs hela längden av den centriole 12,14. En annan viktig faktor är effekten av den genetiska tag på proteinfunktion. Analysera om genetiskt märkta proteiner är funktionella kan vara TESted genom införande av transgena proteiner till en mutant bakgrund och undersökning av om den transgena proteiner räddar den mutanta fenotypen.
Fixering av Drosophila testiklar kan utföras med hjälp av olika kemiska fixeringsmedel. Här beskriver vi fixering med såväl formaldehyd (spår B) och metanol-aceton (spår C). Emellertid kan antingen fixativ användas omväxlande och eftersom olika fixativ kemiskt kan störa nativa antikroppsepitoper, måste valet av lämplig fixativ för immunofärgning bestämmas experimentellt. Följande fixativ och inkubationsbetingelser användes vanligen: 3,7% formaldehyd, 5 min vid rumstemperatur, metanol, 15 min vid -20 ° C; aceton, 10 min vid -20 ° C; metanol, 15 min vid -20 ° C. följt av aceton, 30 sek vid -20 ° C, etanol, 20 min vid -20 ° C. Även fixering med aceton, metanol och etanol inte kräver en utökad permeabilization steg för immunfärgning, fixering with formaldehyd bör följas av en 1 h inkubation i PBST-B vid rumstemperatur för att permeabilisera cellmembranen och tillåta antikropp tillgång till intracellulära epitop. Vidare är vissa fixativ är mer lämpade för särskilda antigener. Exempelvis formaldehyd fungerar väl för fixering av små proteiner, medan metanol och aceton är väl lämpade för upptagning av stora molekylkomplex 36.
Immunfärgning av Drosophila testiklar har tidigare beskrivits för observation av kromatin strukturer och mikrotubuli cytoskelettet 29,37. Här (spår C), har förfarandet optimerats för analysen av centrosomal strukturer som innehåller genetiskt-taggade proteiner. Vi ger en detaljerad beskrivning av denna procedur för att vägleda personer som är oerfarna av att arbeta i Drosophila testiklar. Detta förfarande innefattar även modifieringar för att förbättra konservering och morfologin hos testiklarna, såsom genom användning av siliconized täckglas och positivt laddade objektglas.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag (R01GM098394) från NIH och National Institute of General Medical Sciences samt bidrag 1.121.176 från National Science Foundation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |