Le développement récent des outils de ciblage de gène rend la production des huitièmes de finale (KO) lapins possible. Dans le présent travail, nous avons généré cinq lapins apolipoprotéine (Apo) C-III KO à l'aide de nucléases à doigt de zinc (ZFN). Ce travail a démontré que ZFN est une méthode très efficace pour produire des lapins KO.
L'apolipoprotéine (Apo) C-III (ApoCIII) réside sur la surface de chylomicrons à plasma (CM), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Il a été reconnu que des niveaux élevés de plasma ApoCIII constitutea facteur de risque de maladies cardiovasculaires (MCV). Niveau de ApoCIII de plasma élevée est souvent corrélé à la résistance à l'insuline, l'obésité et l'hypertriglycéridémie. Précieuses connaissances sur les rôles des ApoCIIIin métabolismes lipidiques et les maladies cardiovasculaires a été obtenue à partir des modèles de souris transgéniques, y compris les souris knock-out (KO) ApoCIII, mais il est à noter que le métabolisme de la lipoprotéine chez la souris est différente de celle de l'être humain dans de nombreux aspects. On ne sait pas jusqu'à présent si plasma élevé ApoCIII est directement athérogène. Nous avons travaillé à développer des lapins ApoCIII KO dans la présente étude basée sur l'hypothèse que les lapins peuvent servir reasonablemodelfor étude du métabolisme lipidique et l'athérosclérose humaine. Lapin doigt de zinc nucléase (ZFN) ensembles ciblant ApoCIIIgene ont été soumis à une validation in vitro de l'embryon avant la micro-injection. L'ARNm a été injecté dans le cytoplasme de lapin 35 Des embryons au stade pronucléaire, et a évalué les taux de mutation à l'état de blastocyste. De seize blastocystes qui ont été testés, un taux satisfaisant de 50% de mutation (8/16) sur le site de ciblage a été atteint, supportant l'utilisation de l'ensemble 1 pour des expériences in vivo. Ensuite, nous avons micro-injecté 145 embryons avec Set 1 ARNm, et transféré ces embryons à 7 lapins bénéficiaires. Après 30 jours de gestation, 21 kits sont nés, dont cinq ont été confirmés comme des lapins ApoCIII KO après PCR tests de séquençage. Le taux des animaux KO (# kits KO / total né) était de 23,8%. Le rendement global de production est de 3,4% (5 kits/145 embryons transférés). La présente étude a démontré que ZFN est une méthode très efficace pour produire des lapins KO. Ces lapins ApoCIII KO sont de nouveaux moyens pour étudier les rôles des ApoCIII dans les métabolismes lipidiques.
L'apolipoprotéine (Apo) C-III (ApoCIII) est une petite protéine sécrétoire O-glycosylé qui est synthétisée principalement dans le foie et l'intestin. Il se trouve sur la surface de chylomicrons à plasma (CM), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). ApoCIII a été reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire 1. Les patients présentant un déficit héréditaire de ApoCIII ont un faible taux plasmatique de triglycérides (TG) des niveaux et réduit l'athérosclérose de l'artère coronaire infraclinique 2,3. Niveau de ApoCIII de plasma élevée, d'autre part, est en corrélation avec souvent une résistance à l'insuline, l'obésité, l'hypertriglycéridémie et (HTG) 4,5.
Gene KO (KO) est un moyen puissant pour étudier la fonction d'un gène. En accord avec les observations dans les populations humaines mutantes, knock-out du gène ApoCIII chez la souris conduit à une réduction des TG plasmatiques et de la protection de HTG postprandiale 6. Ce rôle positif de ApoCIII apparud'être indépendant de l'apolipoprotéine E (ApoE), comme les souris déficientes en ApoE et de deux ApoCIII sont également protégés contre l'hyperlipidémie postprandiale 7. Bien que ces modèles de souris KO ApoCIII ont fourni des informations précieuses sur les fonctions possibles de l'ApoCIII chez l'homme, il est noté que le métabolisme de la lipoprotéine de souris est différente de celle de l'être humain dans de nombreux aspects. Par exemple, la souris ne dispose pas de cholestéryle plasmatique de protéine de transfert d'ester (CETP), une enzyme importante impliquée dans le transport des VLDL, LDL, HDL et 8. Par conséquent, il est nécessaire de développer un modèle animal approprié pour mieux comprendre le rôle physiologique de l'ApoCIII in vivo.
Le lapin est un modèle classique espèces animales 9-11. Il a une courte période de gestation (30-31 jours), grande taille de la portée (4-12/litter) et peut être logé commodément dans une installation intérieure. Par rapport à des souris, les lapins sont phylogénétiquement plus proches des humains 10. Surtout, comme hul'homme, mais contrairement aux souris, les lapins sont des mammifères de LDL-riches et ont des niveaux substantiels de la CETP 10,12. De plus, ils sont sensibles à l'athérosclérose induite par l'alimentation riche en cholestérol avec des lésions similaires à celles observées dans l'athérosclérose humaine 13. Pour ces raisons, nous avons supposé que les lapins ApoCIII KO peuvent servir de meilleur modèle que leurs homologues de souris pour étudier les rôles des ApoCIIIplay dans le métabolisme lipidique et l'athérosclérose chez les humains.
Production de gène transgénique ciblé (GTT) lapins a été un défi. Ceci est principalement dû à l'absence de la lignée germinale de transmettre des cellules souches embryonnaires (ESC), et la très faible efficacité de transfert des cellules somatiques (TNCS) chez les lapins. ESC est le principal outil pour générer des souris GTT, alors que SCNT et a été appliquée avec succès pour générer des animaux KO en espèces manque germinales CES transmission, y compris les porcs, les moutons et les bovins, mais pas les lapins. Récemment Zinc Finger nucléase (ZFN), Tranabonnement Activator-Like effecteur nucléase (TALEN) 14, et de l'ARN endonucléase guidée (RGEN) 15 émergé moyens puissants pour l'édition du génome. Ces nucléases, dites "ciseaux moléculaires", sont efficaces dans la génération de cassures double brin (DSB) dans le génome qui peuvent conduire à un KO fonctionnelle du gène ciblé ou utilisées pour intégrer une séquence d'ADN à un locus spécifique dans le génome dans un certain nombre d'espèces 16. En 2011, parmi les premiers adapter la technologie ZFN, nous avons généré des peroxysomes gamma récepteur activé par les proliférateurs (PPAR) des cellules porcines KO par cette approche et générés succès porcs PPARy KO après l'utilisation de ces cellules pour SCNT 17. Dans la même année, la rupture efficace des gènes d'immunoglobulines et le remplacement ciblé chez des lapins à l'aide de ZFN également été rapportés 18.
Dans la présente étude, cinq lapins ApoCIII KO ont été générés comme l'a confirmé par séquençage PCR, en utilisant ZFN Set 1 (voir la figure 1 </strong>. pour organigramme illustration). Ces animaux sont de nouveaux moyens pour étudier les rôles des ApoCIII dans les métabolismes lipidiques.
Dans le présent travail, cinq lapins ApoCIII KO ont été générés en utilisant la technologie ZFN. Auparavant, le seul rapport de la production de lapins GTT a également utilisé la technologie ZFN 18. Le présent travail a confirmé que ZFN est utile pour cibler efficacement les gènes chez les lapins.
Dans la présente étude, le taux transgénique (positif kits / total né) is23.8% (5/21), qui est comparable à celle du précédent rapport ZFN chez les lapins (30,8%, 16/52) 18, et ceux qui ont déclaré d'utiliser ZFN dans d'autres espèces animales, y compris les poissons zèbre ont 19, 20 souris, les rats et les cochons 21 17. Ce taux est en effet plus élevée que les taux de nombreuses études de production classiques lapin transgénique, qui tombent normalement dans la plage de 5 à 20%. Par exemple, dans un effort pour produit ApoCIII lapins transgéniques par micro-injection d'ADN classique, Ding et al. Obtenu trois fondateurs positifs sur 54 petits nés (5,6%) 22.
Conformément aux résultats précédents, les mutations sur les sites de ciblage sont variables, y compris des délétions ou des insertions consistant nombre différent de bases (allant de 1 à 21 dans les cinq lapins KO). Sur la base de l'information de séquence spécifique des animaux fondateurs, il est prévu qu'au moins quatre (c.-à-. Ceux contenant Δ1, 1, 1, ou des mutations Δ20) aurait une perte de fonction de l'ApoCIII. R-16 animaux avec Δ21 peut pas afficher la perte fonctionnelle, cette mutation est prévu pour que la perte de sept acides aminés de cause, mais pas un décalage du cadre de lecture. En fin de compte, les essais phénotypiques sont nécessaires pour déterminer si ces animaux fondateurs présentent vraiment la perte des fonctions ApoCIII.
Aucun des cinq lapins KO générés dans la présente étude contiennent des modifications bialléliques. Il est intéressant, c'est aussi le cas dans le précédent rapport de lapin ZFN. En revanche, lorsque le ciblage ZFNs α1 ,3-galactosyltransférase ont été appliquées à cochoncellules, la fréquence de ciblage d'un seul allèle distance de 7 à 46%, à environ un tiers de mutations créant une seule étape biallélique défonçables 23. En accord avec cela, lorsque TALEN a été appliquée à des cellules de fibroblastes de porc, les modifications bialléliques ont été trouvés dans environ 15 à 40% des clones positifs totaux 14. Il est possible que le défaut de générer des lapins KO biallèles dans la présente étude peut indiquer une différence d'espèce (c.-à-lapins vs porcs) pour une telle capacité de gène de la nucléase à base de ciblage. Il est, cependant, plus probable que ce soit simplement parce que le nombre de lapins KO découlant de ce projet est relativement faible. Nous croyons que ZFN est capable de générer des mutations bialleic chez les lapins, qui doivent être considérés comme un autre avantage potentiel de production de lapin GTT base ZFN. D'autres expériences sont nécessaires pour confirmer cette capacité de ZFN chez les lapins.
En conclusion, ce travail montre que ZGénique basée FN approche de ciblage est efficace dans la production de lapins KO. En particulier, nous avons généré cinq lapins ApoCIII KO avec un taux transgénique satisfaisante de 23,8%. Ces animaux sont censés fournir des informations plus pertinentes sur le rôle de cette protéine sur les métabolismes lipidiques chez les humains que les modèles de souris correspondant. Nous prédisons ciblage de gène à base de ZFN, ainsi que d'autres technologies à base de nuclease tels que TALEN RGEN et, chez les animaux nonmurine facilitera considérablement le développement de nouveaux modèles animaux pour l'étude de diverses maladies humaines.
Figure 1. Diagramme de production de lapins à élimination directe en utilisant la technologie ZFN. La production de lapins à l'aide de la technologie KO ZFN commence par la sélection du gène d'intérêt. L'information de séquence est fourni, ensembles ZFN sont conçus, et subjecte à la levure basé validation interne. Au point de contrôle (CP) 1 (CP-1), seuls les jeux passés validation interne (50% ou plus du contrôle positif interne) seront fournis aux utilisateurs pour la sélection. Si aucun jeux passent CP-1, séquence supplémentaire peut être nécessaire pour concevoir des ensembles ZFN efficaces. Une validation in vitro de l'embryon est suivie pour assurer l'ensemble ZFN sélectionné peut induire des mutations dans des sites sélectionnés (CP-2). Ensemble (s) ZFN ne sera utilisée que si elle passe CP-2 (> = 10% taux de mutation chez les embryons in vitro). Échec CP-2 nécessitera une refonte des ensembles ZFN. donneurs d'embryons seront préparés et embryons au stade pronucléaire seront micro-injectés avec les ensembles ZFN validés. Ces embryons micro-injectés seront transférés aux bénéficiaires de l'embryon synchronisés. Après la période d'un mois de gestation, les nouveau-nés seront génotypés (CP-3). Si aucun des nouveau-nés sont positifs, la micro-injection supplémentaire sera effectué. Il faut 2-3 mois du début du projet à CP-2, en supposant que ninsuffisance o au cours du processus. Il faut 2-3 mois supplémentaires de CP-2 pour CP-3. Par conséquent, il est possible de générer un lapin de finale dans un délai de 4-6 mois en utilisant la technologie ZFN. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Conception ZFN. Trois ensembles de ZFN (Set 1, 2, et 3) ont été conçus en ciblant des séquences sur l'exon 1 ou Exon 2 de lapin ApoCIII (A). Les trois ensembles ont été soumis à la levure MEL-1 journaliste dosage pour déterminer les activités ZFN. Selon les protocoles du fabricant, qui montrent ZFNs> 50% des activités de celle du contrôle positif interne de la fabrication sont considérés comme utiles pour in vitro et in vivo génome expériences d'édition.Les activités étaient ZFN 224,2% pour l'ensemble 1, 196,9% pour la série 2 et 177,8% pour Set 3 (B), donc Set 1 a été sélectionné dans la présente étude. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Validation in vitro d'embryons de ZFN. L'ARNm (5 ug / ml) de l'ensemble 1 a été micro-injecté dans le cytoplasme de 35 pronucléaire embryons de lapin de l'étape (A). Embryons vidées sans traitement de micro-injection (n = 31) ont été utilisés comme groupe témoin. Le taux de développement BL était de 77,4% dans le groupe témoin. Dans le groupe microinjecté, le taux était de 51,4% BL. 16 BLS soumis à un séquençage PCR, 8 (50%) ont été identifiés comme positif, indiquant Set 1 est un ensemble ZFN efficace pour induire des mutations à la targeting place (B, apoc3wt.seq, noir-boîte) de ApoCIII chez les lapins. Le BLS contenant des mutations sont BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, et 17 (B, rouge souligné). Le BLS restants (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 et 16) n'ont pas de mutations sur le site de ciblage. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. La production de lapins ApoCIII KO. Cent quarante-cinq embryons micro-injectés avec ZFN Set 1 ARNm ont été transférés à 7 lapins bénéficiaires pseudo-enceinte (A). Embryons fraîchement rincée (n = 75) sans microinjection ZFN ont été transférées à des destinataires (n = 6) que le groupe témoin. Le taux à long terme calculée en kits terme total / embryons au total dans le groupe de l'expérience est de 140,5% (21/145), alors que le taux est de 29,3% (22/75) dans le groupe témoin (A). Sur les 21 kits nés dans le groupe microinjecté, cinq (R1, R9, R11, R12 et R16) ont été identifiés kits KO comme positifs après séquençage PCR (B). Les indels sur le site de ciblage comprennent deux insertions (1 à la fois pour R9 et R11) et trois suppressions (Δ1, Δ 20, Δ 21 pour R1, R12 et R16, respectivement). Cliquez ici pour agrandir l'image .
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été partiellement financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé (HL105114, HL088391, NS066652, et HL068878 à la SEY), l'American Heart Association (National Scientifique développement 0835237N à JZ). YEC est soutenu financièrement doté Frederick Huetwell professeur de médecine cardiovasculaire à l'Université de Michigan Medical Center (UMMC). Ce travail utilise Core Services pris en charge par Centre pour les modèles avancés pour sciences translationnelle et Therapeutics (CAMTraST) à UMMC.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |