जीन को लक्षित उपकरणों में हाल ही में विकास पीटकर का उत्पादन (को) खरगोश संभव बनाता है. काम में मौजूद है, हम जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFN) का उपयोग करते हुए पांच अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III को खरगोश उत्पन्न. इस काम ZFN को खरगोश का उत्पादन करने के लिए एक बेहद कारगर तरीका है कि प्रदर्शन किया.
अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III (ApoCIII), प्लाज्मा भोजन की वसा के पाचन एवं अवशोषण के पश्चात् रक्त में पाया जाने वाला वसालीका का छोटा कण (मुख्यमंत्री) की सतह पर बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल) और उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) रहता है. यह स्वीकार किया गया है कि हृदय रोगों के लिए प्लाज्मा ApoCIII constitutea जोखिम कारक (सीवीडी) के उच्च स्तर पर. बुलंद प्लाज्मा ApoCIII स्तर अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध, मोटापा, और हाइपरट्राइग्लिसरीडेमिया साथ संबद्ध है. हालांकि, यह चूहों में लिपोप्रोटीन की चयापचय कई पहलुओं में मनुष्य के उस से अलग है कि विख्यात है, ApoCIIIin लिपिड metabolisms और सीवीडी की भूमिका पर अमूल्य ज्ञान ApoCIII पीटा (को) चूहों सहित ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से प्राप्त किया गया है. यह अब बुलंद प्लाज्मा ApoCIII सीधे मेदार्बुदजनक है कि क्या जब तक ज्ञात नहीं है. हम खरगोश मानव लिपिड चयापचय और atherosclerosis का अध्ययन कर एक reasonablemodelfor के रूप में काम कर सकते हैं कि परिकल्पना पर आधारित अध्ययन में मौजूद ApoCIII को खरगोशों को विकसित करने का काम किया. जिंक उंगली nuclease (ZFN) सेट को लक्षित खरगोश ApoCIIIgene पूर्व भ्रूण microinjection के लिए इन विट्रो सत्यापन के अधीन थे. mRNA 35 खरगोश pronuclear चरण भ्रूण की कोशिका द्रव्य को इंजेक्शन, और ब्लास्टोसिस्ट राज्य में उत्परिवर्तन दरों मूल्यांकन किया गया था. Assayed गया कि सोलह ब्लास्टोसिस्ट्स की, लक्ष्यीकरण स्थल पर एक संतोषजनक 50% उत्परिवर्तन दर (8/16) में vivo प्रयोगों के लिए 1 सेट के उपयोग का समर्थन हासिल था. अगला, हम सेट 1 mRNA के साथ 145 भ्रूण microinjected, और 7 प्राप्तकर्ता खरगोश को इन भ्रूण स्थानांतरित कर दिया. 30 दिन के गर्भ के बाद, 21 किट पांच पीसीआर अनुक्रमण assays के बाद ApoCIII को खरगोशों के रूप में पुष्टि की गई जिसमें से, पैदा हुए थे. KO जानवर दर (# KO किट / कुल में जन्म) 23.8% थी. कुल उत्पादन क्षमता (5 kits/145 भ्रूण तबादला) 3.4% है. वर्तमान कार्य ZFN को खरगोश का उत्पादन करने के लिए एक बेहद कारगर तरीका है कि प्रदर्शन किया. ये ApoCIII को खरगोश लिपिड metabolisms में ApoCIII की भूमिका का अध्ययन करने के उपन्यास संसाधन हैं.
अपोलीपोप्रोटीन (ए पी ओ) सी-III (ApoCIII) जिगर और आंत में मुख्य रूप से संश्लेषित है कि एक छोटी सी ओ ग्लाइकोसिलेटेड स्रावी प्रोटीन होता है. यह प्लाज्मा भोजन की वसा के पाचन एवं अवशोषण के पश्चात् रक्त में पाया जाने वाला वसालीका का छोटा कण (मुख्यमंत्री) की सतह पर बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल) और उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) रहता है. ApoCIII हृदय रोग 1 के लिए एक जोखिम कारक के रूप में पहचाना गया है. ApoCIII की वंशानुगत कमी के साथ रोगियों कम प्लाज्मा ट्राइग्लिसराइड (टीजी) के स्तर और कम subclinical कोरोनरी धमनी atherosclerosis 2,3 है. बुलंद प्लाज्मा ApoCIII स्तर, दूसरे हाथ पर, अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध, मोटापा, और हाइपरट्राइग्लिसरीडेमिया (HTG) 4,5 के साथ संबद्ध करता है.
जीन पीटा (को) एक जीन के समारोह में अध्ययन करने के लिए एक सशक्त माध्यम है. मानव उत्परिवर्ती आबादी में टिप्पणियों के साथ संगत, चूहों में ApoCIII जीन की पीटकर एक प्लाज्मा टीजी में कमी और भोजन के बाद HTG 6 से सुरक्षा के लिए नेतृत्व किया. ApoCIII के इस तरह के सकारात्मक भूमिका दिखाई दियाApoE और ApoCIII दोनों के चूहों की कमी भी भोजन के बाद हाइपरलिपिडीमिया 7 से संरक्षित कर रहे हैं, अपोलीपोप्रोटीन ई (APOE) के स्वतंत्र होने के लिए. इन ApoCIII KO माउस मॉडल मानव में ApoCIII के संभावित कार्यों पर अमूल्य जानकारी प्रदान की है, यद्यपि यह चूहों की लिपोप्रोटीन की चयापचय कई पहलुओं में मनुष्य के उस से अलग है कि विख्यात है. उदाहरण के लिए, माउस प्लाज्मा cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन (CETP), वीएलडीएल, एलडीएल के परिवहन में शामिल एक प्रमुख एंजाइम, और एचडीएल 8 का अभाव है. इसलिए, यह आगे vivo में ApoCIII की शारीरिक भूमिका को समझने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल विकसित करने के लिए आवश्यक है.
खरगोश एक शास्त्रीय मॉडल पशु प्रजातियों 9-11 है. यह एक छोटी अवधि (30-31 दिन), बड़े कूड़े का आकार (4-12/litter) है और एक इनडोर सुविधा में आसानी से रखे जा सकते हैं. चूहों की तुलना में, खरगोश मनुष्यों 10 जातीवृति के आधार पर करीब हैं. महत्वपूर्ण बात है, जैसे हूआदमी लेकिन चूहों के विपरीत, खरगोश एलडीएल अमीर स्तनधारियों हैं और CETP 10,12 के पर्याप्त स्तर है. इसके अलावा, वे मानव atherosclerosis के 13 में देखा उन के समान घावों के साथ कोलेस्ट्रॉल युक्त आहार प्रेरित atherosclerosis करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. इन कारणों के लिए, हम ApoCIII को खरगोश मानव में लिपिड चयापचय और atherosclerosis में ApoCIIIplay की भूमिका की जांच के लिए अपने माउस समकक्षों की तुलना में एक बेहतर मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं कि धारणा.
जीन का उत्पादन (GTT) खरगोश एक चुनौती रहा है ट्रांसजेनिक को निशाना बनाया. इस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) के प्रसारण के germline की कमी है, और खरगोश में दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण (SCNT) की बेहद कम क्षमता की वजह से है. और SCNT सफलतापूर्वक सूअर, भेड़ और मवेशी, लेकिन नहीं खरगोश सहित germline संचारण ESCs, कमी प्रजातियों में KO जानवरों उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है जबकि ईएससी, GTT चूहों उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक उपकरण है. हाल ही में जिंक फिंगर Nuclease (ZFN), ट्रॅनscription उत्प्रेरक की तरह effector के Nuclease (talen) 14, और शाही सेना गाइडेड endonuclease (RGEN) 15 जीनोम संपादन के लिए के रूप में शक्तिशाली साधन उभरा. इसलिए "आणविक कैंची" नामक ये न्युक्लिअसिज़, लक्षित जीन की एक कार्यात्मक को नेतृत्व करने के लिए या में जीनोम में एक विशिष्ट ठिकाना पर एक डीएनए अनुक्रम को एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल कर सकते हैं कि जीनोम में डबल भूग्रस्त टूटता (डीएसबी) पैदा करने में कुशल हैं प्रजातियों 16 के एक नंबर. 2011 में, ZFN प्रौद्योगिकी आदत डाल पहले के बीच, हम SCNT 17 के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने के बाद इस दृष्टिकोण से और सफलतापूर्वक उत्पन्न PPARγ को सूअरों के माध्यम से peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर गामा (PPARγ) को सुअर की कोशिकाओं को उत्पन्न किया. एक ही वर्ष में, कुशल immunoglobulin जीन विघटन और भी ZFN का उपयोग खरगोश में लक्षित प्रतिस्थापन 18 सूचना मिली थी.
(देखें चित्र 1 ZFN 1 सेट का उपयोग कर, पीसीआर अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि के रूप में वर्तमान अध्ययन में, पांच ApoCIII को खरगोश उत्पन्न किया गया </sटुनिशिया>. प्रवाह चार्ट उदाहरण के लिए). इन जानवरों को लिपिड metabolisms में ApoCIII की भूमिका का अध्ययन करने के उपन्यास संसाधन हैं.
काम में मौजूद है, पांच ApoCIII को खरगोश ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. इससे पहले GTT खरगोश के उत्पादन का केवल रिपोर्ट में यह भी ZFN प्रौद्योगिकी 18 का इस्तेमाल किया. वर्तमान कार्य ZFN प्रभावी ढंग से खरगोश में जीनों को लक्ष्य करने के लिए उपयोगी है कि पुष्टि की.
अध्ययन में मौजूद है, खरगोश में पिछले ZFN रिपोर्ट (30.8%, 16/52) 18 के बराबर है, और उन जो सूचना दी ट्रांसजेनिक दर (सकारात्मक किट / कुल) का जन्म is23.8% (5/21), ज़ेबरा मछली 19, चूहों 20 चूहों 21 और सूअरों 17 सहित अन्य जानवरों की प्रजातियों में ZFN का उपयोग कर की. यह दर सामान्य रूप से 5-20% की सीमा में गिर जो कई पारंपरिक ट्रांसजेनिक खरगोश उत्पादन पढ़ाई, की दर से अधिक वास्तव में है. उदाहरण के लिए, पारंपरिक डीएनए microinjection के माध्यम से उत्पाद ApoCIII ट्रांसजेनिक खरगोश के प्रयास में, डिंग एट अल. (5.6%) जन्म 22 54 पिल्ले से बाहर 3 सकारात्मक संस्थापकों प्राप्त की.
पिछले निष्कर्षों के साथ संगत को लक्षित स्थलों पर म्यूटेशन (पांच को खरगोशों में 1-21 लेकर) ठिकानों की विभिन्न संख्या मिलकर विलोपन या सम्मिलन सहित, चर रहे हैं. संस्थापक जानवरों के विशिष्ट अनुक्रम जानकारी के आधार पर यह (Δ1, 1, 1, या Δ20 म्यूटेशन युक्त उन अर्थात्.) ApoCIII के समारोह में नुकसान होता है कि कम से कम चार भविष्यवाणी की है. इस उत्परिवर्तन सात अमीनो एसिड के ही कारण नुकसान की भविष्यवाणी की है, लेकिन एक पढ़ने फ्रेम बदलाव नहीं किया गया है के रूप में पशु आर -16 Δ21 साथ, कार्यात्मक हानि प्रदर्शित नहीं हो सकता. अंत में, फेनोटाइप assays इन संस्थापक जानवरों वास्तव में ApoCIII कार्यों की हानि प्रदर्शित निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं.
वर्तमान अध्ययन में उत्पन्न पाँच को खरगोशों से कोई biallelic संशोधनों होते हैं. दिलचस्प है, यह भी पिछले ZFN खरगोश की रिपोर्ट में मामला है. इसके विपरीत, ZFNs α1 ,3-galactosyltransferase लक्ष्य बनाते समय सुअर के लिए लागू किया गयाकोशिकाओं, 23 knockouts biallelic एकल कदम बनाने परिवर्तन के लगभग एक तिहाई के साथ, 7-46% से लेकर एक एकल एलील को निशाना बनाने की आवृत्ति. Talen सुअर fibroblast कोशिकाओं को लागू किया गया था जब इस के अनुरूप,, biallelic संशोधनों कुल सकारात्मक क्लोन 14 के लगभग 15-40% में पाए गए. यह वर्तमान अध्ययन में biallelic को खरगोश उत्पन्न करने के लिए विफलता को लक्षित nuclease आधारित जीन की ऐसी क्षमता के लिए एक प्रजाति का अंतर (यानी खरगोश बनाम सूअर) का संकेत हो सकता है कि संभव है. यह इस परियोजना में उत्पन्न को खरगोश की संख्या अपेक्षाकृत छोटा है क्योंकि यह बस है कि हालाँकि, और अधिक होने की संभावना है. हम ZFN ZFN आधारित GTT खरगोश उत्पादन का एक और संभावित लाभ के रूप में माना जाना चाहिए जो खरगोश में bialleic म्यूटेशन पैदा करने में सक्षम है कि विश्वास करते हैं. आगे के प्रयोगों खरगोश में ZFN की ऐसी क्षमता की पुष्टि करने की जरूरत है.
अंत में, वर्तमान कार्य दर्शाता है कि जेडदृष्टिकोण को लक्षित एफ एन आधारित जीन को खरगोश का निर्माण करने में प्रभावी है. विशेष रूप से, हम 23.8% की एक संतोषजनक ट्रांसजेनिक दर के साथ पांच ApoCIII को खरगोश उत्पन्न. इन जानवरों को इसी माउस मॉडल की तुलना में मानव में लिपिड metabolisms पर इस प्रोटीन की भूमिका के बारे में अधिक सार्थक जानकारी प्रदान करने के लिए माना जाता है. हम ZFN आधारित जीन लक्ष्यीकरण, साथ ही इस तरह के talen और RGEN के रूप में अन्य nuclease आधारित प्रौद्योगिकियों की भविष्यवाणी, nonmurine पशुओं में काफी विभिन्न मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए उपन्यास पशु मॉडल के विकास की सुविधा होगी.
चित्रा 1. ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग पीटकर खरगोश के उत्पादन के चार्ट प्रवाह. ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग को खरगोश का उत्पादन ब्याज की जीन के चयन के साथ शुरू होता है. अनुक्रम जानकारी ZFN सेट तैयार कर रहे हैं, प्रदान की, और Subj हैected खमीर को घर में मान्यता आधारित है. जाँच बिंदु (सीपी) 1 (सीपी -1) में, घर में मान्यता (आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के 50% या अधिक) पारित केवल उन सेट के चयन के लिए उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराया जाएगा. कोई सेट सीपी -1 गुजरती हैं, तो अतिरिक्त अनुक्रम प्रभावी ZFN सेट को डिजाइन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन विट्रो भ्रूण मान्यता चयनित ZFN सेट चयनित साइटों (सीपी -2) में म्यूटेशन पैदा कर सकते हैं सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाता है. यह (इन विट्रो भ्रूण में> = 10% उत्परिवर्तन दर) CP-2 गुजरता अगर ZFN सेट (ओं) ही उपयोग किया जाएगा. सी.पी. -2 में विफलता ZFN सेट का एक नया स्वरूप की आवश्यकता होगी. भ्रूण दाताओं तैयार हो जाएगा और pronuclear चरण भ्रूण मान्य ZFN सेट के साथ microinjected किया जाएगा. ये microinjected भ्रूण सिंक्रनाइज़ भ्रूण प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित किया जाएगा. एक माह के गर्भ की अवधि के बाद, नवजात शिशुओं (सीपी -3) genotyped किया जाएगा. नवजात शिशुओं में से कोई भी सकारात्मक रहे हैं, अतिरिक्त microinjection प्रदर्शन किया जाएगा. यह n संभालने, सी.पी.-2 के लिए इस परियोजना के शुरू होने से 2-3 महीने लग जाते हैंप्रक्रिया के दौरान ओ विफलता. यह सीपी -3 के लिए CP-2 से अतिरिक्त 2-3 महीने लग जाते हैं. इसलिए यह ZFN प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक 4-6 महीने की समय सीमा में एक पीटा खरगोश उत्पन्न करने के लिए संभव है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. ZFN डिजाइन. तीन ZFN सेट (, 2 1 सेट, और 3) एक्सॉन 1 या खरगोश ApoCIII (ए) के एक्सॉन 2 पर विभिन्न दृश्यों को लक्षित डिजाइन किए गए थे. सभी तीन सेटों ZFN गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए खमीर एमईएल -1 संवाददाता परख के अधीन थे. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार, निर्माण के आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण की है कि> 50% गतिविधियों बताते हैं कि ZFNs में इन विट्रो और इन विवो जीनोम संपादन प्रयोगों में के लिए उपयोगी माना जाता है.ZFN गतिविधियों इसलिए 1 वर्तमान अध्ययन में चयनित किया गया था सेट, 1 सेट के लिए 224.2%, 2 सेट के लिए 196.9% और सेट 3 (ख) के लिए 177.8% थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
ZFN की चित्रा 3. इन विट्रो भ्रूण मान्यता. सेट 1 की mRNA (5 ग्राम / एमएल) 35 pronuclear चरण खरगोश भ्रूण (ए) के cytoplasm को microinjected किया गया था. Microinjection उपचार (एन = 31) के बिना प्लावित भ्रूण नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया. बीएल विकास दर नियंत्रण समूह में 77.4% थी. Microinjected समूह में, बीएल दर 51.4% थी. पीसीआर अनुक्रमण के अधीन 16 बी एल से 8 (50%) सकारात्मक रूप में पहचान की गई, सेट 1 का संकेत targe में म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी ZFN सेट हैting साइट (बी, apoc3wt.seq, काले बॉक्सिंग) खरगोश में ApoCIII की. म्यूटेशन युक्त बीएलएस बीएल # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, और 17 (बी, लाल रेखांकित). शेष BLS (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 और 16) लक्ष्यीकरण साइट पर म्यूटेशन नहीं है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. ApoCIII को खरगोश का उत्पादन. ZFN सेट 1 mRNAs साथ microinjected एक सौ पैंतालीस भ्रूण 7 छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता खरगोश (ए) को स्थानांतरित कर दिया गया. ZFN microinjection बिना हौसले प्लावित भ्रूण (एन = 75) प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित किया गया है (n = 6) नियंत्रण समूह के रूप में. प्रयोग समूह में कुल अवधि किट / कुल भ्रूण के रूप में गणना की अवधि की दर 14 है.5% (21/145), दर नियंत्रण समूह में (22/75) 29.3% है, जबकि (ए). Microinjected समूह, पाँच (आर 1, R9, R11, R12 और R16) में पैदा हुए 21 किट के बाहर पीसीआर अनुक्रमण (बी) के बाद के रूप में सकारात्मक को किट की पहचान की गई. लक्ष्यीकरण साइट पर indels दो सम्मिलन (R9 और R11 दोनों के लिए एक) और तीन विलोपन (क्रमशः Δ1, Δ 20, R1, R12 और R16 के लिए Δ 21) शामिल हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
The authors have nothing to disclose.
इस काम आंशिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (HL105114, HL088391, NS066652, और YEC को HL068878), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (JZ को राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास 0835237N). YEC आर्थिक रूप से मिशिगन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर (UMMC) में हृदय चिकित्सा के संपन्न फ्रेडरिक Huetwell प्रोफेसर के रूप में समर्थन किया है. इस काम translational विज्ञान और UMMC में चिकित्सा विज्ञान (CAMTraST) के लिए उन्नत मॉडल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित कोर सेवाओं का उपयोग किया.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |