Summary
Трехмерной проточной камеры устройства является новым
Abstract
Экстравазации циркулирующих клеток из крови играет центральную роль во многих физиологических и патофизиологических процессах, в том числе стволовых клеток самонаведения и метастазирование опухоли. Трехмерной проточную камеру устройство (далее устройство 3D) является новой технологии пробирке, который воссоздает физиологический стресс сдвига и позволяет каждой ступени каскада экстравазации клетки должны быть определены количественно. 3D устройство состоит из верхней камеры, в которой клетки интерес циркулировать при напряжении сдвига, и нижний отсек статического лунок, содержащих хемоаттрактанты интерес. Два отсека, разделенных пористой вставки покрыты монослоем эндотелиальных клетках (ЭК). Необязательный второй вставка с микросреды интерес клетки могут быть помещены непосредственно под слоем EC. Блок газообмена позволяет оптимальное CO 2 напряженность, который поддерживается и предоставляет точку доступа, чтобы добавить или снять клеток или во время соединенияэксперимента. Тест клетки циркулируют в верхнем отсеке в желаемом напряжении сдвига (скорость потока), управляемый с помощью шлангового насоса. В конце эксперимента, циркулирующий и мигрировали клетки собирают для дальнейшего анализа. 3D устройство может быть использован для изучения клетки и кататься по адгезии к ЕС под напряжением сдвига, переселение в ответ на хемокином градиенты, устойчивость к напряжению сдвига, формирования кластеров, и выживание клеток. Кроме того, дополнительный второй вставки позволяет эффекты перекрестных помех между ЕС и микросреды клетки должны быть рассмотрены. Поступательное применения 3D устройства включают в себя испытания лекарств-кандидатов, что целевой миграции клеток и прогнозирования поведения в естественных клеток после внутривенной инъекции. Таким образом, новые устройства 3D является универсальным и недорогим инструментом для изучения молекулярных механизмов, которые опосредуют клеточную экстравазационным.
Introduction
Сотовые экстравазацией это процесс, при котором клетки выходят циркулирующей крови и является важным компонентом многих физиологических реакций в организме. Этот процесс также важен для регенерации тканей, как например, когда терапевтические клетки мобилизовали из тканей в кровеносные сосуды (или вводят внутривенно) мигрируют через сосудистую и выхода циркуляции на сайты травмы или дегенерации. Экстравазация также является важным компонентом патогенеза многих заболеваний, включая воспаление, иммунное отторжение, аутоиммунные заболевания и метастазов опухолей.
Экстравазации представляет собой сложный многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие циркулирующих клеток с эндотелиальные клетки (EC) в условиях физиологического потока. Способ включает (а) клетки прокатки, (б) фирмы адгезией к поверхности просвета ЕС, и (с) переселение через ЕК. Важно отметить, что каждый шаг экстравазации каскад регулируется подмножество СELL конкретного типа и вида, что специфические молекулы. Однако подробный молекулярных механизмов, которые регулируют экстравазацией конкретных подгрупп клетки не до конца понятны, в основном из-за технических трудностей сводный условиях в крови. Новое устройство 3D описанная здесь, направленные на преодоление этих технических проблем и позволить эксперименты должны быть выполнены, что улучшит наше понимание биологии миграции клеток.
Молекулы, которые обеспечивают миграцию клеток являются важным терапевтическим целям. Детальное понимание молекулярных событий, которые контролируют миграционные специфические типы клеток поможет определить новые цели для терапевтического продвижения или ингибирование экстравазационным. Например, вмешательств, которые увеличивают миграцию терапевтические стволовые клетки (полученные от взрослых, неонатальный или даже из фетальных тканей) в сторону участков травмы или дегенерации будет иметь большую полезность в регенерации тканей.Существует растущий интерес в пробирке поколения терапевтических стволовых клеток, включая клетки, полученные из плюрипотентных источников, а в бывших естественных условиях манипулировать взрослыми стволовыми клетками (расширена, генетически модифицированные и предварительно обработанных различными ферментами) 1. Таким образом, существует необходимость в новых технологий для оценки качества стволовых клеток, прежде чем они будут использованы в терапевтических целях. Среди других параметров, клетки должны быть способны эффективно выхода циркуляции, так как лечение мультифокальной расстройств может потребовать внутривенного введения стволовых клеток 2. Действительно, одна из текущих проблем в биологии стволовых клеток заключается в преодолении крайне низкой эффективностью, с которой стволовые клетки дома к местам повреждения тканей 3-6, что свидетельствует о необходимости устранить этот пробел в нашем понимании стволовой клеточной миграции. В отличие от стратегии, которые блокируют клеточную миграцию на специфические самонаведения молекулы были бы полезны для лечения ввоспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также метастатического рака. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, которые обеспечивают взаимодействие между циркулирующих клеток и ЕС во время миграции клеток и экстравазацией имеет отношение к трансляционной медицины и лекарственных препаратов, а также для фундаментальной науки.
Есть в настоящее время целый ряд методов, доступных для изучения различных аспектов миграции клеток. Однако эти способы имеют недостатки, которые могут быть преодолены с новым 3D устройства.
Животные модели:
Модели на животных, например мышей с ослабленным иммунитетом и генетически модифицированных мышей, были полезными инструментами для изучения миграции клеток человека в естественных условиях. Тем не менее, один существенный недостаток этих моделей является то, что клетки человека плохо взаимодействуют с молекулами адгезии присутствует на мышь ЕС, в частности в связи с видоспецифической различия в последовательности многих молекул клеточной поверхности. Таким образом, использование грызунов изучатьмиграции клеток человека вряд ли достоверно отражают события в человеческий организм конкретного сосудистого ложа. Кроме того, в естественных условиях модели не подходят для высокопроизводительного скрининга лекарственных кандидатов. Обычными в естественных условиях модели, использующие для изучения клетки самонаведения не делают различий между различными этапами экстравазацией каскадом, что делает его трудно определить и целевую романа самонаведения молекул. Прижизненной микроскопии подход был разработан для удовлетворения этой потребности и был информативным, однако, этот метод очень много времени и трудоемких 7,8.
Статический анализ переселения:
Transwell или камеры Бойдена анализов мере миграции клеток через пористую мембрану и широко используются в миграционных исследований. Анализ имеет то преимущество, что он может быть использован для изучения не только подвижность клеток и клеточного внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия, но и хемокинов-опосредованной миграции клетокчерез монослой EC, выращенных на пористых мембран. К сожалению, фенотип и функции ЕС в статических условиях существенно отличаются от тех, в физиологических потока 9,10. Таким образом, хемотаксическими события, которые происходят в анализах Transwell не точно имитировать взаимодействия между мигрирующих клеток и ЕС под напряжением сдвига. Кроме того, "скользящий" шаг самонаведения каскад, который добавляет дополнительное измерение селективности процесса в целом, не происходит в статическом анализе Transwell. Таким образом, в то время как эта технология действительно позволяет количественной оценки хемокином-опосредованной миграции клеток через монослой ЕС, она ограничена в неспособности обеспечить напряжение сдвига, который имитирует кровотока в естественных условиях.
Анализы под напряжением сдвига:
Стена напряжения сдвига, как известно, играют важную роль в регуляции функции EC 9,10. Поперечные силы вызывают быструю активацию сигнальных каскадов, Закавкription факторов, и дифференциальной экспрессии генов в ЕС 11,12. Эта информация привела к разработке нового поколения адгезии анализы - параллельный ламинарный поток камеры и капилляры - изучить прокатки и адгезию клеток к ЕС в условиях напряжение сдвига 7,13. Ограничивающим фактором для этих тестов состоит в том, что они могут измерять только прокатки и адгезии, но не делают различия между сторонником ячейку, которая будет продолжаться, чтобы переселиться и приверженцем ячейки, «арестован» на монослое ЕС и не будет переселяться. Кроме того, эти анализы не может измерить миграцию клеток к хемокинов градиента.
Несколько докладов описали способность прилипшие клетки ползать под монослой ЕС выросли на предметных стеклах в условиях потока 14. Ограничения этого ползающих техники включают в себя: он анализирует только ограниченное количество клеток, это неколичественного, она анализирует клетки ползающих на матрице и челПоверхность л, но не по отношению к миграции хемотаксический градиент, и это не позволяет переселено клетки должны быть изолированы. Таким образом, хотя этот метод имеет то преимущество применения напряжения сдвига в монослое EC, он не может количественно миграцию клеток к хемокинов градиента.
Новые 3D технологии, описанной здесь преодолевает многие из этих недостатков путем объединения усилие сдвига (верхний отсек) со статическим градиент хемокина (нижний отсек) и обеспечивает количественную оценку каждой стадии экстравазации каскада (рис. 1). Устройство также может быть использован для исследования как перекрестные помехи между ЕС и микроокружение влияет на способность ЕС для поддержки экстравазации циркулирующих клеток. Следующий протокол описывает шаг за шагом методологии использовании 3D устройство камеры потока.
Protocol
1. Подготовьте Верхней и Нижней Вставки для роста клеток путем нанесения Коллаген
- Рассчитать количество пластин, необходимых для эксперимента. Место каждой вставки в отдельные стерильные чашки Петри (35 х 10 мм) и стерилизуют путем облучения (11 Гр).
- Подготовка раствора коллагена для покрытия мембраны: 50 мкг / мл, 154 мкл на вставку (вставить площадь поверхности 1,54 см 2).
- Место несколько капель (~ 20 мкл на каплю) из раствора коллагена в круг на поверхности вкладыша мембраны (не позволяют кончика пипетки касаться поверхности), а затем осторожно добавляют остальную часть аликвоты с образованием одной большой капли на поверхности мембраны. Убедитесь, что коллаген раствор остается полусферических и не сливает воду с поверхности мембраны.
- Накройте чашку Петри с крышкой и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре на плоской поверхности.
- Аспирируйте раствор коллагена и мыть мембраны один раз покрытие с 160 мкл PBS.
- AspiraTE PBS и закрыть крышкой. Если вы используете тот же день, поместите чашку Петри в сухом месте при комнатной температуре. В противном случае, поместите блюдо при 4 ° С и использовать вставку в течение 7 дней.
2. Культуре эндотелиальных клеток на Верхней Вставки
- Подготовка EC суспензии в желаемое культуральной среды. Убедитесь, что жизнеспособность клеток> 98% и использовать немедленно.
Примечание: для пупочной вены человека EC (HUVEC), 4 х 10 5 клеток в 160 мкл на вставке используется.
- Возьмите чашку Петри с коллагеном-покрытием и вставками подготовлены в разделе 1; не снимайте вставками из блюд. Место несколько мелких капель клеточной суспензии (приблизительно 20 мкл на каплю) в круг на поверхности покрытых коллагеном мембраны (не позволяют сенсорный наконечник пипетки поверхности), а затем осторожно добавляют остальную часть клеточной суспензии, чтобы сформировать одну большую каплю. Убедитесь, что клеточная суспензия остается Хеми pherical и не сливает воду с поверхности мембраны.
- Замените крышки и осторожно поместите посуду в 5% CO 2 инкубаторе для клеточных культур и инкубировать (без встряхивания) при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к мембране.
- Осторожно добавляют 5 мл культуральной среды в каждую чашку Петри обеспечение того, чтобы вставка остается на дне тарелки и полностью покрыт средой. Замените крышки и осторожно положил обратно блюд в инкубаторе. Культуры клеток при 37 ° С в течение ночи.
- Использование такой же подход подготовки второй (дополнительный) нижний вкладыш с клетками, представляющих местные микросреду, который будет размещен ниже вставку, содержащую слой EC.
Примечание: если нижний вставки включены в экспериментах верхней и нижней вставки первой соединены друг с другом до размещения вставки в 3D-устройство (фиг.4В).
е "> 3. Соберите устройство 3D проточной камеры- Винт вместе верхней и нижней пластин, подключение плиты к блоку газообмена использованием труб, поместить собранное устройство в чистый пластиковый мешок, и стерилизуют мешок и содержимое путем облучения (11 Гр).
- Удалите лоток готовые из культуры клеток инкубатор, место в стерильный капот культуры ткани, спрей с 70% этанола, вытрите, а затем крышку лотка с большим стерильной салфеткой.
- Поместите облученных полиэтиленовом пакете в капюшон, удалить устройство из сумки и место на стерильный лоток инкубатора. Подключите устройство к перистальтического насоса с трубка поставляется. Программа насос для оптимальной скоростью 0,2 мл / мин.
Примечание: Для соединения насоса с электрической розеткой, выдавливать электрического шнура через отверстие в задней инкубаторе. Используйте грабителя вилку шнура вокруг, чтобы убедиться, что отверстие герметичным.
4. Премьер-3D устройств проточной камеры
- Отсоедините впускной трубы из розетки, потянув за металлической иглы от трубки (используйте небольшие стерильные салфетки для поддержания стерильности трубки). Используйте металлические игла, соединенная с трубкой, как "входе" и прерванная конец трубки, как "выход". Размещайте наливной металлической иглы в 15 мл трубки со средствами массовой информации; разместить розетки в пустую 15 мл трубки.
- Включить насос так что поток против часовой стрелки и установите расход при 0,2 мл / мин. Разрешить отрицательное давление, чтобы привлечь среды от 15 мл впускную трубу в трубку и останова насоса При достижении конца трубки непосредственно перед ней подключается к устройству (рис. 2, остановка № 1).
- Отвинтите верхнюю и нижнюю пластины устройства. Осторожно снимите верхнюю пластину и место 1500 - 1550 мкл Mediмкм (или только среды или плюс экспериментальных хемокинов) в нижнее скважин. Убедитесь, что также содержит достаточное количество среды с образованием полушарие, которое достигает примерно 1 - 2 мм над нижней пластиной.
- Передача подготовленных вставку из чашки Петри в лунки нижней пластины с использованием стерильных щипцов, убедившись, что не должно быть пузырьков под вставками. Аспирируйте любой носитель, который появляется на поверхности нижней пластины для того, чтобы пластина остается сухим. Поместите верхнюю пластину обратно на нижней пластине и повторного соединения пластины с помощью винтов.
- Сразу включить перистальтического насоса и позволяют среда течь через устройство 3D. Поднимают выходном конце устройства и поддерживать камеру в таком положении, чтобы предотвратить образование пузырьков в пространстве между пластинами.
- Разрешить среды для заполнения камеры и трубки подключения камеры к блоку газообмен. Остановите насос непосредственно перед измеряемый продукт доходит до электронного газаXchange устройства (фиг.2; Стоп 2). Место 3 мл среды в аппарат газообмена, включить насос и дайте воздушные пузыри, чтобы бежать через блок газообмен. Поднимите блок газообмена, чтобы позволить среде, чтобы заполнить трубопровод, выходящий из блока газообмена и остановить насос, когда среда достигает 2 - 3 см до конца сливная трубка (рис. 2, № 3 остановки).
- Подключите входной металлической иглой к розетке через небольшие стерильные салфетки. Перепрограммирование насоса таким среда протекает в противоположном направлении (по часовой стрелке) в направлении блока газообмена и обеспечить пузырьки воздуха удаляются только они достигают блок газообмен. Проверьте, нет ли пузырьков воздуха остаются в системе.
- Перепрограммирование насос так втекает против часовой стрелки. Добавить 100 мкл суспензии клеток тест на блок газообмен. Закройте крышку блока газообмен, поместите поднос с рабочей системой обратно в инкубатор, и позволяют клеткам тест циркулирующихе в 3D устройства при 37 ° С в течение требуемого времени.
Примечание: Очистить электрический шнур из насоса с 70% этанола и поместите его в инкубатор.
5. Закончить проверку и сбор образцов для анализа
- Извлеките лоток с рабочей системой из инкубатора и место в капюшоне. Остановите насос, отсоедините входе и выходе, и поместить концы в пустые стерильные 15 мл пробирок.
- Поворачивать на насосе и собирать клеточной суспензии из системы; место клеточной суспензии на льду, при необходимости, до использования.
- Разберите камеру, удалив винты и отрывая верхнюю пластину. Снимите вставками из нижней пластины и передавать их в чашки Петри.
Примечание: Вставки могут быть окрашены для визуализации и Граф клеток на месте (кристаллический фиолетовый 0,05% в дН 2 O) или трипсином собрать ЕС для дальнейшеготестирования.
- Удалить среды и клеток из нижней скважин в пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 210 х г. Удалить супернатант, мыть и ресуспендирования клеток по желанию, и обрабатывать клетки в зависимости от конкретных экспериментальных целей (обсуждается ниже).
Representative Results
Мышиные костномозгового происхождения ЕС линии STR-12 выращивали на пластины с порами 5 мкм. Скорость роста EC контролировали под микроскопом, и когда EC составили 100% сплошности, вставки переносили в лунки в нижнем отсеке 3D устройства. Непосредственно перед размещении вставки, лунки нижнем отделении были заполнены культуральной среде (отрицательный контроль) или среде, дополненной стромальной клетки, полученные фактор-1 (SDF-1, 5 нг / мл и 50 нг / мл). После этого устройство 3D была собрана и камера была заполнена среде, как описано в протоколе. Испытательные камеры, который будет распространен в верхнем отсеке устройства были свежесобранных мышиных клеток костного мозга (3,5 × 10 6 клеток в камере). Определены напряжении сдвига 0,8 дин / см 2 был применен путем установки перистальтического насоса при скорости 0,2 мл / мин. Вся система рабочая затем помещали в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C и CELLS были допущены к обращению и взаимодействовать с ЕС монослоя в течение 4 часов. В конце этого времени, циркулирующий клетки собирали, камера была разобрана, а вставки делали удалена, как описано в протоколе. Переселено клетки собирали из нижней скважин, промывали, ресуспендировали в свежей среде и переносили в метилцеллюлозы культурах, дополненных гемопоэтические факторы роста колоний-образующих ячейки (CFC) анализ (фиг.3). Как и ожидалось, мы обнаружили, что значительно большее количество CFC которые мигрировали через монослой EC в лунки, содержащей 50 нг / мл SDF-1, чем в лунки, содержащие 5 нг / мл SDF-1 или только среды.
Как описано выше, ни один из методов тока в пробирке доступны для изучения миграции клеток не способны тестирования эффекта местного микросреды на способности ЕС поддерживать экстравазации мигрирующих клеток. Чтобы проиллюстрировать, как это может быть достигнуто с 3D устройство, мырассмотрен экстравазации циркулирующих гемопоэтических клеток через слой EC и слоем стромальных клеток костного мозга. Для этого второго (нижнего) вставку, содержащую слой стромальных клеток сопоставлении с верхним вкладышем, содержащим монослой EC в нижней плите (рис. 4). Далее этот эксперимент проводили, как описано выше, и переселились клетки собирали из лунок и подсчитывали. Результаты показали, что введение дополнительного слоя стромальных клеток под EC монослой значительно увеличило миграции гемопоэтических клеток к SDF-1 (рис. 4). Этот вывод согласуется с понятием, что местные микросреды способствует набору циркулирующих клеток в ткани.
Рисунок 2. Схематическое представление системы 3D устройства. На чертеже показаны три ступени, необходимые для сборки системы. Культуральная среда всасывается из впускного отрицательным давлением, создаваемым перистальтического насоса. Поток среды перекрываться стоп № 1, чтобы позволить вставками быть помещены в устройство. После того как камера закрыта, насос SwitCHED снова и камера немедленно заполнена средой для предотвращения высыхания клеток, выращенных на вставках. Стоп # 2 позволяет среда быть размещены в блоке газообмена. Стоп № 3 обеспечивает поток должен быть остановлен для подключения на входе и выходе. Поток может быть направлен по часовой или против часовой стрелки, чтобы удалить пузырьки воздуха через блок газообмена с помощью переключателя на насосе.
Рисунок 3. Устройство поддерживает 3D SDF-1-опосредованную переселение гемопоэтических предшественников в условиях физиологического напряжения сдвига. : Три устройства (каждый из которых содержит 3 скважины в нижнем отделении) были собраны и выполняться параллельно. Средний отдельно или средой, содержащей SDF-1 в 5 или 50 нг / мл была добавлена в нижний отсек скважин. Мышиные БоКлетки мозга пе были допущены к обращению в устройствах в течение 4 часов. После этого каждое устройство разбирают и клетки, которые переселились к SDF-1 (желтый) были собраны из нижние лунки, подсчитывали и культивировали в метилцеллюлозы дополнена гемопоэтические факторы роста (GF). Четырнадцать дней спустя, колонии были обнаружены под микроскопом B:. Количество предшественников (колониеобразующих клетках, CFC) оправился от нижних отсеков приведены в виде среднего ± SD из трех скважин в состоянии. * Р <0,05.
Рисунок 4. Влияние микросреды на взаимодействие между гемопоэтических клеток и эндотелиальных клетках. : На рисунке показано положение вторую пористую мембрану с культивируемыми йRomal фибробластов (SF) под верхней мембраны с ЕС. Другие сокращения, как описано для фиг.1А B:.. Дополнительный мембраны (нижняя вставка) с культивируемыми SF был вставлен под верхней мембраны C: Три устройств (каждый из которых содержит три скважины) были выполняться параллельно. Средний отдельно или средой, содержащей SDF-1 в концентрации 50 нг / мл SDF-1 был добавлен в нижние лунки отсека. Отрицательный контроль камеры SC опущена, SDF-1, или обоих. Клетки костного мозга может циркулировать в течение 4 ч при 37 ° С. После этого каждое устройство разбирают и переселились клетки собирали из нижнего отсека скважин и подсчитывали. Количество переселено клеток, выделенных показан как среднее значение ± SD трех скважин в состоянии. * Р <0,05.
Discussion
3D устройство может быть полезной технологией для проведения исследований в различных областях, включая биологии стволовой клетки, биологии сосудов, гематология, онкология, аутоиммунные заболевания и воспаление. 3D устройство будет особенно полезно для исследователей, изучающих гемопоэтические, мезенхимальные, нейронные и других стволовых клеток исследовать молекулярные механизмы, регулирующие каждый шаг экстравазации каскад стволовых клеток. Исследователи, изучающие миграцию клеток также можете использовать это устройство для изучения различных миграционных механизмов Т-и В-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов, НК-клеток и других мигрирующих клеток. В биологии сосудов, устройство будет полезно для оценки влияния местного микросреды на способности ЕС поддерживать клетки набора и имитировать гематоэнцефалический барьер в пробирке. Для исследователей, сосредоточив внимание на патогенез болезни, устройство может быть использовано для изучения миграции цитотоксических Т-клеток в поджелудочную железу при диабете типа I, Мимиграция эозинофилов в легких больных астмой, миграцию нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов в участках воспаления в различных расстройств, набор клеток к заживлению ран сайтов, взаимодействие цитотоксических Т-клеток с сосудистой, и работа цитотоксических Т-клеток в опухоли.
Новое устройство 3D также будет полезным инструментом для поступательного науки и для доклинической разработки лекарств и скрининге. Например, устройство может быть использована для оптимизации подготовке терапевтического клеточные суспензии для внутривенного введения, для проверки набора терапевтические клетки в поврежденные ткани по сравнению с нормальными тканями, а также исследовать роль конкретного органа или ткани эндотелия и микросреды в этом процесса. Для разработки лекарственных средств, устройство может быть использована для проверки лекарств-кандидатов, что опухолевые клетки-мишени и блокирует каждый шаг экстравазации каскадом, чтобы проверить мигрирующих клеток в качестве лекарственного средства доставитьу транспортного средства в опухоль сайтов, чтобы проверить препараты, которые регулируют функции органов человека конкретной эндотелий или местного тканеспецифические микросреду, и для проверки комбинации препаратов, которые регулируют различные этапы самонаведения каскада. Наконец, когда превращается в высокой пропускной способности системы, устройство может быть использована для скрининга малых молекул, пептидов и антител, молекул-мишеней посредническую клетки людьми.
Технические характеристики и советы
Качения и сцепления под потока критических шагов в экстравазацией каскадом и вносят значительный вклад в эффективность миграции клеток в живом организме. Примечательно, что эти шаги не способствуют статического анализа в лабораторных условиях. Тем не менее, анализ статических переселении полезны в качестве отрицательного контроля в экспериментах тестирования эффектов касательное напряжение на выживание и функционирование клеток, в том числе способности ЕС поддерживать низкое сродство взаимодействий (прокат) и прочная адгезия.
Выбор среды для экспериментов в 3D устройство имеет важное значение. Медиа содержат различные факторы роста, которые могут влиять на выживание циркулирующих клеток, особенно при длительной инкубации. Кроме того, концентрации Са 2 + и Mg 2 +, который может влиять на адгезивные взаимодействия в условиях физиологического потока, значительно изменяться в коммерческих культуральных сред. Другие технические детали, которые должны быть приняты во внимание при планировании экспериментов с 3D устройства будут рассмотрены ниже.
Выбор EC монослой
Подпись клеточной поверхности EC зависит от различных параметров, в том числе виды и ткани происхождения и условий культуры клеток, которые должны быть приняты во внимание при эксперимента. Некоторые часто используемые ЕС включают легких полученных микрососудистые EC (LDMVEC), костномозгового происхождения ЕС (BMDEC), полученного из головного мозга EC (BDEC) и HUVEC.Свойства ИК также меняются в зависимости от их происхождения. Например, BMDEC конститутивно экспресс-селектина и VCAM-1, которые ответственны за прокатки и адгезии, тогда как BDEC, LDMVEC и HUVEC не экспрессируют эти молекулы при нормальных условиях. Таким образом, вставки покрыты BDEC, LDMVEC и HUVEC может быть предварительно обработан TNF-α (10 нг / мл, 4 ч) или другие факторы, которые имитируют воспаление и индуцируют экспрессию самонаведения молекул.
Тестирование перекрестные помехи с местными микроокружение
Существует растущий интерес к пониманию того, как местные микросреды регулирует функции ЕС и участвует в клеточном экстравазационным. Наши результаты показывают, что введение монослой клеток стромы под EC монослой значительно увеличивает экстравазации циркулирующих клеток. Этот результат показывает, что перекрестные помехи между ЕС и стромы повышает способность ЕС для поддержки экстравазации циркулирующих клеток. Moreoверсии, введение клеток от различных микросреды (например, мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов легких, опухолевые клетки, астроциты) может помочь, чтобы имитировать конкретный сосудистых ложах. В частности, сочетание полученного из головного мозга EC и астроцитов может быть полезным подход имитировать через гематоэнцефалический барьер. Кроме того, клетки, полученные от пациентов, или нормальные клетки манипулировать в пробирке, может помочь имитировать конкретного больного микросреды.
В наших исследованиях мы использовали нижний вставки с стромальных клеток выросла до 50% слияния. Хотя оптимальная плотность микросреды клеток на вставки будет зависеть от цели исследования, это может быть легко манипулировать и контролировать.
Выбор скорости сдвига стресс
Напряжении сдвига 0,8 дин / см 2 были использованы здесь, потому что это было продемонстрировано фон Андриан и соавт. быть напряжение сдвига в костном мозге microvasculaturЕ, где гемопоэтические клетки-предшественники выхода из обращения и введите тканей в нормальных физиологических условиях 15. В отличие от более высоких уровней напряжения сдвига наблюдаются в более крупные суда, где сотовые экстравазацией ограничено. Поэтому высоких скоростях сдвига стресс может быть использован в качестве дополнительного контроля за экспериментах по исследованию транссудации различных типов клеток.
Выживаемости клеток под напряжением сдвига зависит от нескольких факторов, в том числе от типа клеток и бывших естественных клеток лечение (Гончарова и др.., Неопубликованные наблюдения), и таким образом, должны быть тщательно проанализированы в ходе испытания. Сотовые чувствительность к различным уровнем напряжения сдвига (сопротивление сдвигу стресс) может быть вычислен путем программирования перистальтического насоса для увеличения скорости сдвига напряжение постепенно от 0,8 дин / см 2 до 6 дин / см 2. В течение этих испытаний клетки могут быть собраны периодически из камеры газообмена для контроля гибели клеток с использованием в качествеговорит, такие как исключение трипанового синего, аннексин V и PI окрашивания и выражения апоптоза маркер.
Если эксперименты призваны протестировать сопротивление сдвигу стресса бывших естественных условиях сконструированные клетки или клетки, полученные из паренхимы, рекомендуется дополнительный положительный управления, такие как клетки, передающихся через кровь, включаются в экспериментах.
Выбор размера вставки пор и ECM покрытие
Вставки могут поставляться с несколькими размерами пор (3, 5 и 8 мкм). Выбор размера пор будет зависеть от размера и свойств циркулирующих клеток тест, который также в случае статического анализа Transwell. Вставки с большим размером пор (8 мкм) рекомендуется проверить экстравазации крупных клеток, таких как опухолевые клетки эпителиального происхождения. Лейкоциты или гемопоэтических стволовых клеток чаще протестированы с пор 5 мкм вставки и пор 3 мкм вставки лучше использовать для тестирования экстравазации секМаллер клеток. Однако размеры испытательной камеры сама по себе не является единственным важным фактором, и мы рекомендуем тестирования вставки с несколькими размерами пор.
В наших первоначальных исследований, мы протестировали различные ЭСУД на их способность поддерживать рост ЭС по вставками и выдерживать напряжение сдвига в течение> 4 часов. ECM тестировали включены Матригель, поли-D-лизин, фибронектин, ламинин, типа я коллагена, гидрогель, мета-кератин I, II, III, IV, и Extracel. Наилучшие результаты для роста EC были получены с Extracel, фибронектина и коллагена. Тем не менее, в наших руках, Extracel на уровне 0,8 мкг / см 2 значительно сократили переселение теста клетки через мембрану. Поэтому мы сейчас используем фибронектина (5 мкг / см 2) или коллагена (5 мкг / см 2) для покрытия вставками. Тем не менее, оптимальный выбор ECM, вероятно, будет зависит как от типа ЕС и transmigratory свойства тестируемых клеток. Предварительном эксперименте, должно быть выполнено для проверки integriTY монослоя ЕС выросли на выбранном ECM. Например, места предварительного покрытием и вставками с монослоя ЕС в чашках Петри, заполненный культурой носителях, размещать блюда на шейкере для создания напряжения сдвига (низкое значение), и инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 12 часов. Целостность ЕС после воздействия напряжения сдвига можно оценить с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым.
Выбор оптимальной концентрации испытательной камере
Способность тестируемых клеток, чтобы выйти из циркуляции зависит от многих особенностей, характерных для каждого типа клеток. Для генерации статистически значимые результаты, циркулирующей плотности клеток должны быть оптимизированы, чтобы обеспечить достаточное количество клеток мигрировать в положительной контрольных лунках. Следовательно, рекомендуется выполнить начальный тесты с диапазоном плотности клеток (например, 10 3 / мл до 10 7 / мл), чтобы понять взаимосвязь между количеством клеток загружен в систему иЧисло клеток, которые подвергаются переселение.
Кроме того, в оптимальной концентрации циркулирующего могут отличаться по тем же типом клеток, полученных из различных источников. Например, CD34 +-клетки представляют собой гетерогенную популяцию клеток, содержащих как гемопоэтических стволовых клеток и совершенные линии конкретных предшественников. Они могут быть получены из костного мозга, периферической крови мобилизован и пуповинной крови. CD34 + клетки, полученные из этих трех источников обладают различными самонаведения и прививка способностей 16-18, так что условия для проверки этих клеток в 3D-устройство должно быть оптимизировано до полномасштабного исследования.
Выбор оптимального времени циркуляции ячейки
Оптимальное время циркуляции должны быть определены эмпирически для каждого типа клеток. Минимальное время, необходимое для циркуляции можно экстраполировать из результатов статического анализа миграции, но это может быть доста точно широкоДед, когда клетки подвергаются напряжению сдвига. Экспериментальные исследования тестирования циркуляции раз от 4 до 96 часов рекомендуется.
Устройство газообмена
Основной целью блок газообмена является поддержание оптимальной концентрации CO 2 в среде, циркулирующей через 3D устройство, аналогичные параметры в стандартном инкубаторов культуры ткани. Устройство газообмен также может быть использован для добавления тестируемых клеток и соединений и для сбора проб и образцов во время испытания.
Оценка номера испытательной камере
Циркулирующих клеток можно отведать в разное время во время эксперимента через блок газообмен. В конце эксперимента клетки, остающиеся в обращении могут быть собраны из розетки. Когда устройство 3D разобрана в конце эксперимента, переселились клетки могут быть собраны из нижней скважины и собирают еили дальнейшего анализа. Если входные клетки немеченого, переселились клетки могут быть окрашивали трипановым синим и живых / мертвых клеток, перечисленных под микроскопом. Кроме того, входные клетки могут быть помечены с одним из многих "клетка отслеживания" красителей для изображений живых клеток перед загрузкой в 3D устройство, в данном случае, собранной переселено клетки должны быть лизируют для количественного определения флуоресценции.
Выбор оптимального размера выборки
Для проведения статистического анализа, размер выборки должен быть выбран, что обеспечит около 80% мощности для обнаружения гипотетической разницы в средних процентных изменений между двумя группами при испытании при уровне значимости 0,05 помощью двусторонней Т-тест. Основываясь на нашем опыте с клетками костного мозга, мы используем три скважины в экспериментальных условиях для 3D эксперименты устройства. Однако оптимальный размер выборки будет изменяться с целью эксперимента и должно быть определено электроннойmpirically. Множественная регрессия статистические тесты, двусторонняя т-тесты и анализ дисперсии может быть использована для проверки статистической значимости результатов.
Выбор хемокинами
Как и во всех анализах переселение, выбор хемоаттрактантных будет определяться свойства тестируемых клеток и цель исследования. SDF-1 представляет собой хорошо отработанную хемоаттрактант для гемопоэтических клеток. В руках, концентрации 50 нг / мл SDF-1 является оптимальным для стимуляции экстравазации костного мозга гемопоэтические клетки-предшественники. Мы также используем C3a и BFGF как хемоаттрактанты для мезенхимальных стволовых клеток 19. Тем не менее, мы рекомендуем титрования каждого хемокинов и кросс-сочетания титрующий хемокинами определить оптимальный диапазон концентрации до полномасштабного исследования. Для определенных типов клеток, сочетание хемотаксических факторов может быть полезным. Если хемокинов для отдельных ячеек теста неизвестны или недоступны, Конректных информации из стимулированных лимфоцитов, фибробласты и другие клетки могут быть использованы в качестве источника хемоаттрактанты.
Выбор считывания параметров
Универсальность 3D устройств будет расширяться типа переселения экспериментов, которые могут быть выполнены, и успех эксперимента будет зависеть от вдумчивого рассмотрения и дизайн считывания параметров. Как правило, клетки, собранные из верхней (обращении) отсек и нижний (статический) отделение должны быть проверены на жизнеспособность в то же время как подсчет клеток. Некоторые клетки обладают низкой толерантностью к физиологическим напряжением сдвига наблюдаются в микроциркуляторном русле. В этом случае, число мертвых клеток будет увеличена в верхнем отсеке. Количество прикрепленных клеток арестован (или ловушку) на слой ЕС может быть оценена путем иммуноцитохимия маркеров выражены в частности с помощью теста клеток. Антитела, специфичные для CD31 и фактора Виллебранда может быть использовандля обнаружения и ЕС, чтобы позволить дискриминацию между тестом клетки и ЕС. Кроме того, целостность EC монослой следует контролировать в конце каждого теста.
Типы анализов, выполненных с собранными клетки будет зависеть от экспериментальных целей следователей, но могут включать в себя анализ изменений в экспрессии генов и микрочипов кПЦР, поверхностные молекулы выражения анализа FACS, активация сигнальных путей на FACS и вестерн-блоттинга, а фактор секреции ELISA. Огромный массив функциональных тестов возможны на собранные клетки в пробирке, о чем свидетельствуют наши собственные работы, в которой мы культивировали переселились клеток костного мозга для перечисления гемопоэтических клеток-предшественников (рис. 3). Собранные образцы могут быть испытаны в различных в естественных условиях анализа.
Одним из важных параметров, которые могут помочь предсказать поведение тестируемых клеток в естественных условиях является, как правилоENCY некоторых клеток с образованием агрегатов при различных скоростях сдвига стресс. Например, терапевтические клетки, которые подвергаются образование агрегатов в 3D-устройство может иметь большую тенденцию к образованию комков после внутривенного введения и вызвать острый обструкции сосудов в естественных условиях (Goncharova соавт., Неопубликованные данные). Совокупное образование можно контролировать микроскопически путем отбора проб тестируемых клеток во время или после завершения 3D эксперимент устройства.
Disclosures
Каскад LifeSciences Инк обладает эксклюзивными правами на патент США 7927867 В2 "Устройство для оценки миграции клеток в пробирке в условиях потока и методов их применения". СКК является изобретателем технологии 3D камеры устройства потока и научных соучредителем и акционером Каскад LifeSciences Инк
Acknowledgments
Мы благодарим Чак Скотт и Виктор Мак-Найт из CBS Научно Company, Inc ( www.cbsscientific.com ) для помощи проектирование и изготовление 3D камера, газообмена блок и вставляет. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (гранты R21DK067084 и R43CA141782 к SKK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133) | Lonza | CC - 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER - CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 - 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 - 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 | |
References
- Daley, G. Q. The promise and perils of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).
- Khaldoyanidi, S.
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, 612-630 (2008).
- Lapidot, T., Kollet, O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Smart, N., Riley, P. R.
- Khaldoyanidi, S. K., et al. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions. J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).
- Le Devedec, S. E., et al. Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo. Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).
- Barakat, A. I. Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review). Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M. Shear force and its effect on cell structure and function. ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).
- Cinamon, G., et al. Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow. J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).
- Arber, C., et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).
- Fuji, S., et al. Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).
- Haspel, R. L., Miller, K. B. Hematopoietic stem cells: source matters. Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).
- Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation. J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).
