自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡
Summary
我々は、自由に同期して、感覚の内部に特別に設計された水槽の両方で正確かつ確実に、動物の電気器官吐出タイミング、上体位置姿勢を測定することにより、長時間にわたって弱電気魚の水泳の自発的挙動を研究するための技術のセットを記述隔離室。
Abstract
長期の行動追跡は、発生頻度の少ないものを含めて天然の動物行動を捕捉し、定量化することができます。このような探査と社会的相互作用のような行動は最高の気ままな、自由に行動する動物を観察することによって調べることができる。弱い電気魚（WEF）ディスプレイ、電気オルガン放電（EOD）を放出することによって容易に観察探索および社会的行動。ここでは、同期EOD、身体位置、および長期間自由遊泳WEFの姿勢を測定するために3つの有効な技術を記載している。まず、光、音、振動などの感覚刺激の外部ソースをブロックするように設計された隔離室の内部に実験槽の構成を記載している。水槽は、4つの試験片を収容するために区画され、自動化されたゲートは、遠隔中央アリーナに対する動物のアクセスを制御した。第二に、我々は自由にWEF水泳より正確で信頼性のあるリアルタイムのEODタイミング測定方法を説明。動物の身体の動きに起因する信号歪みは、空間的および時間的平均化処理ステージで補正される。第三に、我々は非摂動夜行性動物の行動を観察する水中近赤外イメージングのセットアップについて説明します。赤外光パルスは、長い記録時間にわたってビデオ及び生理学的信号間のタイミングを同期するために使用した。私達の自動化されたトラッキングソフトウェアは、水生シーンで確実に動物の身体の位置や姿勢を計測する。組み合わせて、これらの技術は、自由に確実かつ正確な方法で、弱電気魚の水泳の自発行動の長期的な観察を可能にする。我々は我々の方法は、同様に探索や社会的行動との生理学的信号を関連付けることにより、他の水生動物の研究に適用することができると信じています。
Introduction
背景 。動物の行動に関する定量的実験（ 例えば強制選択、ショック回避、T-迷路などが ）一般的に感覚運動技能、学習と記憶形成に関する特定の仮説を調査するために利用される。しかし、これらの制限の実験は、天然の動物の行動の豊かさの多くを欠場し、行動の基礎となる神経基盤の単純化モデルとなる可能性が高い。より自然な条件の下での実験は、それゆえ我々は、より完全に種の行動レパートリーを探ることのできる重要な補完である。自由に動く動物を含む実験は、しかし、このような動きによって誘発される記録の成果物として、それぞれの技術的な課題に対処する必要があります。刺激誘発反応とは異なり、自然発生探索行動を予測することはできません。このように実験対象は常に監視され、長期間にわたって追跡されなければならない。具体的な研究課題では、CANベスト厳選された生物および利用可能な技術的なツールによって対処する。例えば、そのような遺伝的にコードカルシウムセンサーとして光記録及び刺激技術1および2の光遺伝学正常に自由に遺伝モデル生物の3-5を移動させるために適用されてきた。代わりに、小型化された神経遠隔計測システムは、記録することができますし、小動物の6,7の移動を自由に刺激する。
電気魚 。 WEFの種は、彼らの身近に感知するために以上の長距離での通信を可能にする、電気オルガン放電（EODs）を生成します。 EODsの時間的なパターンは、自己の運動8,9、感覚刺激10,11、および社会的相互作用12,13等の異なる条件で異なります。連続的な擬似正弦波形を生成するための波型の種とは対照的に、パルス型WEF種は、離散的なパルス列を生成する。一般に、パルス型種展示MORE変数EOD率が波型種と比較し、そして動物のEOD率は密接に彼らの感覚周囲10,14の新規性の内容を反映している。パルス型の種はすぐに新たな感覚摂動（新規性応答10,11,14）への対応の単一パルス周期内でパルス間間隔（IPI）を短縮することができます。これらの魚の継続的な電気挙動は、外部からの制御不能な感覚刺激によって乱さすることができ、かつ、振動、音、電気、光などの刺激の異なる種類のトリガーノベルティ応答を知られている。そのため、特別な措置は、自由遊泳WEFの長期観察中に外部感覚刺激をブロックしたり、減衰させるように注意する必要があります。このように、EOD速度及び移動軌跡の変化は、具体的に実験者によって提示された刺激に起因し得る。
水槽と隔離室。そこで振動吸収材料の複数の層を置いたU大水槽（2.1 MX 2.1 MX 0.3メートル）NDER、光、電気的ノイズ、音と熱流束の外部ソースをブロックするために絶縁された筐体でタンクを囲んだ。 EOD率は、このように水温がしっかり南米WEFの種のために熱帯の範囲（25±1℃）に調節した、周囲の温度15,16によって異なります。私たちは、主に2次元（ 図1A）に制限されたWEFの空間探索行動を観察するために大きな浅い（10cmの水深）タンクを構築した。タンクは、空間的挙動を観察するために、中央の場に分配し、四隅の区画は、別々に、個々の魚（ 図1B）を収容する。各区画は、個人間の電気通信を防ぐために、防水建てられました。中央アリーナ動物のアクセスは4電動ゲートで外部からコントロールした。ゲートは、区画間に配置され、ロックされたときには、水密になったナイロンウィングナットで。 WEFは、金属に敏感に反応するので、全く金属部分は水中では使用されなかった。
EOD記録 。 EODsは17,18（Mormyrids中）単一または（Gymnotiforms中）の複数の空間的に分布電気器官の活性化によってステレオタイプのようにして生成される。髄ペースメーカーは、今度は前脳19から軸索投射を受ける間脳prepacemaker核、などの高次脳領域から直接、神経の入力を受け取るため、EOD率の一時的な変調は、より高いレベルの神経活動を明らかにすることができます。しかし、EOD時期は慎重に生波形記録から抽出され、動物の運動誘発性の歪みによってバイアスされていないする必要があります。 WEFによって生成される電界はダイポールとして近似することができるため、記録電極におけるEODパルス振幅は、動物、電極8,20間の相対距離と方向に依存する。動物の自己MOVEMエントは、このような動きは、異なる電極でのEODの振幅が（6月ら 8の図2（b）参照 ）は、揮発性の方法で経時的に変化させ、動物と電極との間の相対的なジオメトリを変更してください。電子オルガンの異なるセットからの相対的な寄与は、テール曲げて導入されたボディの長さと地元の曲率に沿ってそれらの位置に依存しているため、さらに、自己の運動もまた、記録されたEOD波形の形状を変更。 EOD振幅と形状の動きによって誘発される歪みは不正確で信頼できないのEODタイミング測定につながることができます。我々は、空間的に異なる位置に記録された複数のEOD波形を平均化することにより、かつ正確に自由遊泳WEFからEODタイミングを決定するために、エンベロープ抽出フィルタを追加することによってこれらの問題を克服した。加えて、我々の技術は、動物がEODの変化に基づいて、静止または能動的に移動しているかどうかを示すEOD振幅を測定する時間の経過とともに振幅（ 図2Eと2Fを参照してください）。我々は、コモンモードノイズを低減するために、記録電極対から差動増幅された信号を記録した。 EODパルスが不規則な時間間隔で生成されるため、EODイベントの時系列は、可変サンプリングレートを有する。選択肢の解析ツールによって必要な場合EOD時系列は、補間によって一定のサンプリングレートに変換することができる。
ビデオ録画 。 EOD記録は動物の総運動の活動を監視することもできますが、録画は、動物の体の位置と姿勢の直接測定を可能にします。近赤外（NIR）照明（λ= 800〜900 nm）のWEFsは暗闇の中で最も活発であり、その目はNIRスペクトル23,24に敏感ではないので、自由に魚21,22水泳の非摂動目視観察を可能にします。ほとんどのデジタル画像センサ（ 例えば CMOSまたはCCD）がwavelengtとNIRスペクトルをキャプチャすることができますフィルタ25をブロックする赤外線（IR）を除去した後800〜900 nmのHレンジ、。特定のハイエンド消費者向けのウェブカメラは、高精細、広視野角や画質に匹敵する、またはプロ級の赤外線カメラよりも優れて利用できる、はるかに大きなコストを生成することができ、良好な低照度感度を提供しています。また、一部の消費者向けのウェブカメラは、品質上の損失でビデオを圧縮することによって拡張された録画時間を許可する記録ソフトウェアにバンドルされています。ほとんどのプロ級のカメラは、デジタル化された信号と映像とのタイミングを合わせるために26時間の同期TTLパルス出力またはトリガTTLパルス入力を提供していますが、この機能は、消費者向けのウェブカメラで一般に存在しない。しかしながら、映像記録信号デジタイザとの間のタイミングを正確に同時に、カメラと信号デジタイザーで周期的に点滅IR LEDを撮像して一致させることができる。最初と最後のIRパルスタイミングを使用することができるs信号デジタイザ時間単位及びその逆に映像フレーム番号を変換するための2つのタイム較正マーカー。
照明＆背景 。水を介して、撮影は、水の表面での光の反射により、技術的に挑戦することができます。水面、水中、水上ビジュアルシーン、そして曖昧な視覚的特徴を反映するために、ミラーとして機能することができ、したがって水上記のシーンは、視覚的な干渉を防止するために特徴のないレンダリングしなければならない。画像の順序全体水槽では、カメラは水の上に直接配置される必要がある、そしてそれは、水面上での反射を防ぐために小さな視野穴の上の天井の後ろに隠されるべきである。光源が誤って投影される場合には更に、水の表面がグレア及び不均一な照明を生成することができる。間接照明は、天井に向かって光源を目指したことで全体の水槽の上に均一な輝度を達成することができますように、天井と周囲のWALlsが水面に達する前に、光線を反射して拡散することができる。カメラ（ 例えば 850 nmのピーク波長）のスペクトル応答と一致する赤外線照明器を選択してください。光源からの電気的ノイズは、LEDライトを使用し、ファラデーケージの外でDC電源装置を配置することによって最小限に抑えることができる。魚は近赤外波長で白色の背景によく対比さ以来、タンクの下に白い背景を配置します。同様に、隔離室の内面上に白色マットの使用は、均一で明るい背景照明を供給する。
ビデオトラッキング 。録画した後、自動画像追跡アルゴリズムは、経時的に、動物の身体の位置及び姿勢を計測することができる。ビデオトラッキングを自動的にのいずれか、すぐに使用できるソフトウェア（視点又はEthovision）、またはユーザープログラム可能なソフトウェア（またはOpenCVのMATLAB 画像処理ツール ）によって行うことができる。画像追跡の最初のステップとして、有効なトラッキングエリアは、（動作マスキング）の外側の領域を除外するために幾何学的形状を描くことによって定義される必要がある。次に、動物のイメージは、動物を含む画像から背景画像を差し引くことにより、バックグラウンドから単離する必要がある。差分画像は、重心と配向軸がバイナリモルフォロジー演算から計算することができるように、強度閾値を適用してバイナリ形式に変換される。 Gymnotiforms 27〜29と30〜32 Mormyridsでは、電子受容密度は、頭部領域の近くに最高であるため、任意の瞬間にヘッド位置が最も高く、感覚の鋭敏さの位置を示しています。頭部および尾部の位置が自動的に画像回転と境界ボックスの操作を適用することによって決定することができる。頭部および尾部端部は手動で最初のフレームで、二つの連続するフレームを比較から、それらの位置を追跡することによってそれらを定義することにより、互いに区別することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの技術の重要性。要約すると、我々は最初の大水槽の建設やWEFによって生成自発的探索行動を観察する隔離室を説明した。次に、複数の電極対を用いてリアルタイムでEOD速度および無拘束魚からの移動状態を記録および追跡する技術を実証した。最後に、我々は、時間同期の方法で水を介して赤外線ビデオ記録技術、および上体位置姿勢を測定する画像追跡アルゴリズムを記載…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、寛大に自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）と健康の研究（CIHR）のカナダの協会によってサポートされていました。
Materials
| [Aquarium construction] | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | .5 inch thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | .25 inch thick, matt white | |
| Natural rubber sheet | generic | .25 inch thick | |
| Servomotor | HITECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 chan.) | sparkfun.com | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter – 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| [EOD recording setup] | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| [Visual tracking setup] | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| Matlab | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
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