Langsigtet Behavioral Tracking af Frit Svømning Svagt Electric Fish

Summary

Vi beskriver en række teknikker til at studere spontane adfærd svømme frit svagt elektrisk fisk over en længere periode ved synkront at måle dyrets udledning elektrisk orgel timing, kropsstilling og kropsholdning både nøjagtigt og pålideligt i en specielt designet akvarium tanken i en sensorisk isolation kammer.

Abstract

Langsigtet adfærdsmæssige tracking kan fange og kvantificere naturlige dyreadfærd, inklusive dem, der forekommer sjældent. Adfærd, såsom udforskning og sociale interaktioner kan bedst studeres ved at observere uhæmmet, frit opfører dyr. Svagt elektrisk fisk (WEF) display let observerbar sonderende og sociale adfærd ved at udsende elektrisk orgel afladning (EOD). Her beskriver vi tre effektive teknikker til at synkront måle EOD, kropsstilling, og kropsholdning af en fritsvømmende WEF i en længere periode. Først beskriver vi konstruktionen af ​​en eksperimentel beholder inde i en isoleret kammer designet til at blokere eksterne kilder af sensoriske stimuli, såsom lys, lyd og vibrationer. Akvariet blev delt til at rumme fire prøvelegemer og automatiske kontrolposter fjernstyre dyrenes adgang til den centrale arena. For det andet beskriver vi en præcis og pålidelig real-time EOD timing målemetode fra frit svømme WEF. Signal fordrejninger som følge af dyrets kropsbevægelser er korrigeret med rumlig udjævning og stadier tidsmæssige behandling. For det tredje, beskriver vi en undervands nær-infrarød billeddannelse setup til at observere uforstyrrede natdyr adfærd. Infrarødt lys pulser blev brugt til at synkronisere tidsplanen mellem videoen og den fysiologiske signal over en lang optagelse varighed. Vores automatiske tracking software måler dyrets krop position og kropsholdning pålideligt i et akvatisk scene. I kombination af disse teknikker gør det muligt langsigtet observation af spontane adfærd svømme frit svagt elektrisk fisk på en pålidelig og præcis måde. Vi mener, at vores fremgangsmåde kan ligeledes anvendes til undersøgelse af andre akvatiske dyr ved at relatere deres fysiologiske signaler sonderende eller sociale adfærd.

Introduction

Baggrund. Kvantitative eksperimenter på dyrs adfærd (fx tvungen valg, chok undgåelse, T-labyrint, osv.) Er typisk brugt til at undersøge specifikke hypoteser om sansemotoriske færdigheder, indlæring og hukommelse dannelse. Men disse restriktive eksperimenter glip af meget af den rigdom af naturlige dyrs adfærd og vil sandsynligvis resultere i forsimplede modeller af den underliggende neurale grundlag for adfærd. Eksperimenter under mere naturalistiske forhold er derfor et vigtigt supplement, som vi kan udforske mere fuldstændigt en art adfærdsmæssigt repertoire. Eksperimenter med frit bevægelige dyr skal dog løse unikke tekniske udfordringer såsom bevægelse-induceret optagelse artefakter. I modsætning til stimulus-fremkaldte reaktioner, kan spontant forekommende udforskende adfærd ikke kan forudsiges, og dermed forsøgspersoner skal konstant overvåges og følges over en længere periode. Specifikke forskningsspørgsmål can bedst behandles ved nøje udvalgte organismer og tilgængelige tekniske redskaber. For eksempel har optisk registrering og stimulering teknikker såsom genetisk kodet calcium sensorer ¹ og optogenetics ² blevet anvendt med succes til frit at bevæge sig genetiske modelorganismer ^3-5. Alternativt kan miniaturiserede neurale telemetrisystemer registrere og stimulere frit bevægelige smådyr ^6,7.

Elektrisk fisk. WEF arter genererer elektriske udladninger orgel (EODS), som tillader dem at fornemme deres umiddelbare omgivelser eller til at kommunikere over større afstande. Tidsmæssige mønstre af EODS varierer under forskellige forhold som selvstændige bevægelser ^8,9, sensoriske stimuli ^10,11, og sociale interaktioner ^12,13. Puls-type WEF arter producerer et tog af diskrete pulser, i modsætning til bølge-type arter, som genererer løbende kvasi-sinusformet kurver. I almindelighed, puls-typen arter udstille more variabel EOD rente i forhold til bølge-type arter og dyrenes EOD satser afspejler nøje nyhed indholdet af deres sensoriske omgivelser ^10,14. Kan Puls-type arter straks forkorte inter-puls interval (IPI) inden for en enkelt puls cyklus i at reagere på en roman sensorisk forstyrrelse (nyhed svar ^10,11,14). Den igangværende elektriske opførsel af disse fisk kan forstyrres af ukontrollerede sensoriske stimuli fra eksterne kilder, og forskellige former for stimuli, såsom vibrationer, lyd, elektricitet og lys er kendt trigger nyhed svar. Derfor skal der træffes særlige forholdsregler for at blokere eller dæmpe eksterne sensoriske stimuli i løbet af en langvarig observation af fritsvømmende WEF. På denne måde kan ændringer i EOD sats og bevægelse baner specifikt tildeles stimuli præsenteret af forsøgslederen.

Akvarium tank og isolation kammer. Vi har derfor lagt flere lag af vibrationer absorberende materiale under et stort akvarium akvarium (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), og omgivet tanken med en isoleret kabinet til at blokere eksterne kilder af lys, elektrisk støj, lyd og varme flux. EOD afhænger af den omgivende temperatur ^15,16, og dermed vandtemperaturen var stramt reguleret på en tropisk område (25 ± 1 ° C) i Sydamerikansk WEF arter. Vi bygget en stor og lavvandet (10 cm vanddybde) tank for at observere rumlige sonderende adfærd af WEF primært begrænset i to dimensioner (figur 1a). Tanken blev delt ind i en central arena for at observere rumlige adfærd, og fire hjørne rum til separat huse enkelte fisk (figur 1B). Hvert rum blev bygget vandtæt for at forhindre elektrisk kommunikation mellem individer. Dyr adgang til den centrale arena blev styret udefra af fire motoriserede porte. Portene blev placeret mellem rummene, og de blev vandtæt når låstaf nylon wing-nødder. Ingen metaldele blev brugt under vandet siden WEF reagerer sensitivt på metaller.

EOD optagelse. EODS genereres i en stereotyp måde ved aktivering af en enkelt (i Mormyrids) eller flere rumligt fordelte elektriske organer (i Gymnotiforms) ^17,18. Temporal modulationer i EOD rate kan afsløre et højere niveau neurale aktiviteter, da den medullære pacemaker modtager direkte neurale input fra højere områder af hjernen, såsom diencephalic prepacemaker kerne, som igen modtager aksonale fremskrivninger fra forhjernen ^19. Dog skal EOD timing omhyggeligt udvindes fra en rå bølgeform optagelse og ikke påvirket af dyrets bevægelse fordrejninger. Det elektriske felt genereret af en WEF kan tilnærmes som en dipol, og dermed EOD impulsamplituder ved optagelse elektroder afhænger af de relative afstande og orienteringer mellem dyret og elektroderne ^8,20. Dyrets selv-movemforældre ændre den relative geometri mellem dyret og elektroderne, og dermed bevægelser forårsage EOD amplituder på forskellige elektroder til at variere over tid i et volatilt måde (se figur 2B i Jun et al. ^8). Desuden selvstændige bevægelser også ændre formen af ​​indspillede EOD kurver, fordi relative bidrag fra forskellige sæt af de elektriske organer er afhængige af deres placeringer langs kroppen længde og deres lokale krumninger indført ved hale bøjning. Bevægelsessensorerne fordrejninger i EOD amplituder og figurer kan medføre unøjagtige og upålidelige EOD timing målinger. Vi overvandt disse problemer ved rumligt gennemsnit af flere EOD kurver optaget på forskellige steder, og ved at tilføje en konvolut udvinding filter til at præcist at afgøre, EOD timing fra en fritsvømmende WEF. Desuden er vores teknik måler også EOD amplituder, som viser, om et dyr hviler eller aktivt bevæger baseret på ændringen af ​​EODamplituder over tid (se figur 2E og 2F). Vi indspillede differentielt forstærkede signaler fra optagelse elektrodeparrene at reducere common-mode støj. Da EOD impulser genereres med uregelmæssige tidsintervaller, EOD event tidsserier har en variabel samplingfrekvens. EOD tidsserier kan konverteres til en konstant samplingfrekvens ved interpolation hvis det kræves af en analytisk redskab valg.

Videooptagelse. Selvom EOD optagelse kan overvåge en grov bevægelse aktivitet af et dyr, videooptagelse tillader direkte målinger af et dyrs krop position og kropsholdning. Nær-infrarødt (NIR) belysning (λ = 800 ~ 900 nm), tillader uperturberede visuel observation af svømme frit fisk ^21,22, da WEFs er mest aktive i mørke, og deres øjne ikke er følsomme over for NIR spektret ^23,24. De fleste digitale billedsensorer (f.eks CMOS eller CCD) kan fange NIR spektret med wavelength interval mellem 800-900 nm, efter fjernelse af en infrarød (IR) blokerende filter ^25. Visse high-end forbruger-grade webkameraer tilbyder high-definition, bred betragtningsvinkel og god lav lysfølsomhed, der kan producere en billedkvalitet svarende til eller bedre end professionel kvalitet IR kameraer til rådighed på meget større omkostninger. Desuden er visse forbruger-grade webkameraer bundlet med optagelse software, der tillader en udvidet optagelse varighed ved at komprimere video uden tab af kvalitet. De fleste professionel kvalitet kameraer tilbyder tidssynkronisering TTL puls udgange eller udløse TTL pulsindgange ²⁶ til justering af timingen mellem video med de digitaliserede signaler, men denne funktion er generelt fraværende i forbruger-grade webcams. Dog kan timingen mellem en videooptagelse og et signal digitizer præcist modsvares af samtidig erobre et periodisk blinkende IR LED med kameraet og signal digitizer. Den oprindelige og den endelige IR puls timing kan bruges ens to gang kalibrering markører til at konvertere video frame numre til signalet digitizer tidsenhed og vice versa.

Lys & baggrund. Billedoptagelse gennem vand kan være teknisk udfordrende på grund af lysreflekser på vandoverfladen. Vandoverfladen kan fungere som et spejl for at afspejle en visuel scene over vand, og obskure visuelle funktioner under vandet, og dermed scenen over vandet skal gøres konturløse at forhindre visuel interferens. For at billedet hele akvariet, et kamera skal placeres direkte over vandet, og det skal være skjult bag loftet over en lille visning hul for at forhindre sine overvejelser på vandoverfladen. Desuden kan vandoverfladen producere glares og uensartet belysning hvis lyskilder forkert projiceres. Indirekte belysning kan opnå en ensartet lysstyrke over hele akvariet ved at sigte lyskilderne mod loftet, således at loftet og omgivende walls kan reflektere og sprede lyset stråler, før de når vandoverfladen. Vælg en IR lampe, der matcher en spektral respons på kameraet (f.eks 850 nm peak bølgelængde). Elektrisk støj fra lyskilderne kan minimeres ved hjælp af LED-lys og placere deres DC strømforsyninger uden for Faradays bur. Placer en hvid baggrund under beholderen, da fisk kontraster godt i en hvid baggrund på NIR bølgelængder. Tilsvarende anvendelse af mat hvid farve på de indre overflader af isolationskammeret giver en ensartet og lys baggrund belysning.

Video tracking. Efter en videooptagelse, kan en automatiseret billede sporing algoritme måle dyrets kropsstillinger og stillinger over tid. Videosporingssystemet kan udføres automatisk ved enten klar-til-brug software (Viewpoint eller Ethovision) eller bruger-programmerbar software (OpenCV eller Matlab Billedbehandling værktøjskasse). Som første trin i billedet tracking,et gyldigt tracking areal skal defineres ved at tegne en geometrisk form at udelukke området uden (maskering drift). Dernæst skal isoleres fra baggrunden ved at trække baggrundsbilledet fra et billede, der indeholder dyret dyrets billede. Det subtraherede billede konverteres til et binært format ved anvendelse af en intensitet tærskel, således at tyngdepunktet og orienteringen akse kan beregnes ud fra binære morfologiske operationer. I Gymnotiforms ^27-29 og Mormyrids ^30-32, den electroreceptor tæthed er den højeste i nærheden af hovedet regionen og dermed hovedet position på ethvert tidspunkt angiver en placering af højeste sensoriske skarphed. Hoved og hale steder automatisk kan fastsættes ved at anvende billedet rotation og omgivende boks operationer. Hoved og hale ender kunne skelnes fra hinanden ved manuelt at definere dem i den første ramme, og ved at holde styr på deres placeringer fra at sammenligne to på hinanden følgende rammer.

Protocol

Denne procedure opfylder kravene i University of Ottawa Animal Care udvalget. Ingen interessekonflikt deklareres. Der henvises til tabel af materialer og reagenser til de mærker og modeller af udstyr og materialer, der er anført nedenfor. Custom skrevet Spike2 og MATLAB scripts og prøve data findes i Supplemental File. 1.. Akvarium Tank Isolation Chamber Setup Anti-v ibration gulv. Konstruere en anti-vibration overflade (2,1 mx 2,1 m) ved at stable gummi puder, akustis…

Representative Results

EOD trackingresultater De indspillede EOD waveforms fra forskellige elektrode par varierede i amplituder og former som forventet fra deres unikke positioner og orienteringer (figur 2C top). Brugen af ​​flere elektrode par sikrede stærkt signal modtagelse på alle mulige positioner og orienteringer af WEF i tanken. Kuverten bølgeform (figur 2C bund, grøn trace) altid indeholdt en enkelt top per EOD cyklus, der fungerede som en pålidelig tid markør for p…

Discussion

Betydningen af vores teknikker. Sammenfattende vi først beskrevet konstruktionen af et stort akvarium tank og en isolation kammer at observere spontane sonderende adfærd produceret af WEF. Dernæst viste vi teknikken med at optage og spore EOD rente og bevægelsen stater fra uhæmmet fisk i realtid ved hjælp af flere elektrode par. Endelig beskrev vi den infrarøde videooptagelse teknik gennem vand i en tidssynkroniseret måde, og billedet sporingsalgoritmen at måle kropsstilling og kropsholdning. Som en ek…

Materials

			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter – 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox