鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的<em>果蝇</em>成人头由串联亲和纯化（TAP）
Summary
果蝇是著名的强大的遗传操作，但不能进行深入的生化分析其适用性。在这里，我们提出了一个TAP为基础的程序，从果蝇大脑识别任何利益蛋白质相互作用的合作伙伴。此过程有可能导致新的研究途径。
Abstract
利用果蝇 （果蝇）进行遗传筛选已在生物科学的进步提出了许多里程碑式的发现。然而，使用生化屏幕旨在扩大从遗传分析中获得的知识是最近才开发。在这里，我们描述的方法来净化蛋白复合物，随着兴趣的成年苍蝇头任何蛋白质的联系人。这种方法充分利用了果蝇 GAL4/UAS系统来表达融合在苍蝇体内一个神经元串联亲和纯化（TAP）的标签的诱饵蛋白，然后实现两轮净化使用类似于最初建立在一个咨询的过程酵母1，净化相互作用蛋白复合物。在此过程结束时，获得其分子的身份可以通过质谱法来确定多蛋白复合物的混合物。候选蛋白的验证将来自R受益esource和便于执行功能丧失的研究中的苍蝇。类似的方法可以应用到其它蝇组织。我们相信，基因操作和这个蛋白组学方法在果蝇模型系统的结合具有很大的潜力来解决在神经生物学领域及以后的基本问题。
Introduction
定义调解特定的生物过程中的分子途径或网络是生物医学研究的终极目标之一。飞遗传学家们严重依赖正向遗传学，尤其是修饰符遗传筛选（包括增强和抑制屏幕），以确定共同合作，与平行，或上游或目的基因的下游因素。然而，正向遗传学的屏幕，很多时候无法识别重要的基因，如果发生变异，导致杀伤力在早期发育阶段，或与基因功能冗余和补偿其失去功能只会造成细微瑕疵是很难得分。克服这一困难的一种方法是筛选直接的蛋白 – 蛋白相互作用。超过十年，生物化学方法，包括酵母双杂交，噬菌体展示，化学交联，联合知识产权，串联亲和纯化（TAP） 等越来越列表。已被用于研究蛋白质- 蛋白质相互作用。每种方法都有自己的一套优势和问候敏感性和特异性的弱点。其中，TAP方法可以检测物理相互作用下的近生理条件下，保留了特异性和一致性2，并包括延伸到高通量的能力，分析3,4。
最初是由Rigautand同事开发1在酵母中的TAP方法。在该方法中，目的蛋白质的表达用TAP标记。在TAP标签藏着两个独立的亲和力结合结构域：一个蛋白结合于IgG域和钙调素结合结构域。这两个结构域通过一个TEV（烟草蚀纹病毒）裂解位点隔开。这样的组合使得两个独立的两轮亲和纯化，以充分降低非特异性绑定和丰富具体的绑定1。对于这种情况下，TAP方法是一个非常强大的METHOd，来确定在给定的蛋白质的体内相互作用，虽然过表达外源蛋白可使其更易于与蛋白质通常不复杂的，其内源性的对应关联。由于它的发展时，TAP方法已经在许多其他系统，包括细胞培养为基础的系统5,6等体内模型系统应用6-9。在这里，我们描述了果蝇的咨询方法的适应性。我们首先生成pUAST-NTAP和pUAST-CTAP矢量以有利于克隆的TAP标记的融合到感兴趣的基因或N-或C-末端。在UAS-TAP标记的转基因然后在神经GAL4驱动器10的控制下，对神经系统表达。接着，将大量的成年苍蝇头将被收集，其具有神经细胞的高含量，并且容易从身体的其它部位根据大小不同冷冻后分离。成人头均化并清零bŸ连续离心，取上清液受下述TAP程序。
Protocol
Representative Results
Discussion
串联亲和纯化（TAP）的方法提供了双纯化协议，允许通过两个独立的亲和纯化步骤的分离和蛋白质复合物的富集。在TAP标签的设计并不局限于所显示的内容在本协议中，其它蛋白结合结构域和图案也同样适用，如果缓冲液条件进行相应调整。其他的TAP标签的一个很好的例子是GS-TAP标签，G蛋白的结合和链霉亲和结合基序，由Giulio Superti-Furga小组力求在培养的哺乳动物细胞系18纯化蛋白复合物…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢EUROSARF向我们发送咨询酵母表达质粒。我们也感谢来自瑞安Labadens社论帮助。这项工作是由美国国立卫生研究院一/ NINDS补助金（R01NS070962）为CW支持
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
