Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em> Drosophila</em> Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)
Summary
Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.
Abstract
Genetische screens uitgevoerd met behulp van Drosophila melanogaster (fruitvlieg) hebben talloze mijlpaal ontdekkingen gedaan in de opmars van de biologische wetenschappen. Echter, het gebruik van biochemische schermen gericht op uitbreiding van de kennis die uit de genetische analyse werd pas onlangs ontdekt. Hier een methode beschrijven we aan het eiwitcomplex te zuiveren dat associeert met een eiwit van interesse van volwassen vlieg hoofden. Deze methode maakt gebruik van het Drosophila GAL4/UAS systeem lokaas eiwit gefuseerd met een Tandem Affinity Purification (TAP) tag in vlieg neuronen in vivo expressie en vervolgens worden twee ronden van zuivering met gebruik van een TAP werkwijze gelijk aan die oorspronkelijk vastgesteld gist 1 om de interacties eiwitcomplex zuiveren. Aan het einde van deze procedure wordt een mengsel van verschillende eiwitcomplexen verkregen waarvan de moleculaire identiteit kan worden bepaald door massaspectrometrie. Validatie van de kandidaat-eiwitten zullen profiteren van de resource en het gemak van het uitvoeren van verlies-van-functie studies in vliegen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast op andere vliegen weefsels. Wij geloven dat de combinatie van genetische manipulaties en dit proteomics aanpak in de vlieg modelsysteem bezit een enorm potentieel voor de aanpak van fundamentele problemen op het gebied van de neurobiologie en daarbuiten.
Introduction
Het definiëren van de moleculaire pathways of netwerken die een bepaald biologisch proces bemiddelen is een van de uiteindelijke doelen van het biomedisch onderzoek. Vlieg genetici hebben zwaar afhankelijk van forward genetics, vooral modifier genetische screens (zowel enhancer en suppressor-schermen), factoren die samenwerken, parallel met, of stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen van belang te identificeren. Echter, forward genetics schermen vaak niet om essentiële genen te identificeren die, wanneer gemuteerd, veroorzaken dodelijkheid in vroege ontwikkelingsstadia, of genen met functionele redundantie en compensatie waarvan het verlies van de functie alleen leiden tot subtiele defecten die moeilijk om te scoren zijn. Een manier om deze moeilijkheid te overwinnen is het screenen op directe eiwit-eiwit interacties. Voor meer dan een decennium, een groeiende lijst van biochemische methoden, waaronder gist two-hybrid, faag display, chemische cross-linking, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), enz. zijn gebruikt om eiwitten te onderzoeken-Eiwit interacties. Elk van deze benaderingen heeft zijn eigen set van sterke en zwakke punten met betrekking tot de gevoeligheid en specificiteit. Onder hen, kan de TAP detectiemethode voor fysieke interactie onder nagenoeg fysiologische omstandigheden, behouden specificiteit en samenhang 2 en omvat de mogelijkheid om uit te breiden tot hoog-analyses 3,4.
TAP methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in gist door Rigautand collega 1. Bij deze werkwijze wordt een eiwit van interesse tot expressie met een TAP-tag. De TAP-label herbergt twee onafhankelijke affiniteit bindende domeinen: een eiwit Een domein dat bindt aan IgG en een-calmoduline bindend domein. De twee domeinen worden gescheiden door een TEV (Tobacco Etch Virus) splitsingsplaats. Een dergelijke combinatie zorgt voor twee onafhankelijke rondes van affiniteit zuiveringen voldoende niet-specifieke bindingen te verminderen en te verrijken specifieke bindingen 1. Voor dit geval, de TAP methode is een zeer krachtige methodiekd identificeren in vivo interactie van een bepaalde proteïne, hoewel overexpressie het exogene proteïne kan meer vatbaar voor koppelen met eiwitten die normaal niet complex met zijn endogene tegenhanger maken. Sinds de ontwikkeling, heeft de TAP methode is toegepast in vele andere systemen, waaronder cel-cultuur-gebaseerde systemen 5,6 en andere in vivo modellen voor de 6-9. Hier beschrijven we de aanpassing van de TAP methode in Drosophila. We hebben eerst genereren pUAST-NTAP en pUAST-CTAP vectoren klonering en fusie van de TAP-tag aan de N-of C-uiteinde van het gen van belang te vergemakkelijken. De UAS-TAP gelabeld transgen wordt vervolgens uitgedrukt in het zenuwstelsel onder controle van een neuronale GAL4 driver 10. Vervolgens zal een groot aantal volwassen vlieg koppen worden verzameld, die hoog gehalte aan neurale cellen en zijn gemakkelijk te scheiden van andere lichaamsdelen na bevriezing basis van grootte verschillen. De volwassen hoofden zijn gehomogeniseerd en opgeruimd by sequentiële centrifugeren, en het supernatant is onderworpen aan een hieronder beschreven TAP procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) heeft een dubbele zuiveringsprotocol dat de isolatie en verrijking van eiwitcomplexen via twee onafhankelijke affiniteit zuiveringsstappen maakt. Het ontwerp van de TAP-tag is niet beperkt tot wat in dit protocol, andere proteïne bindende domeinen en motieven zijn ook van toepassing als bufferomstandigheden dienovereenkomstig aangepast. Een goed voorbeeld van andere TAP tags is het GS-TAP tag, een combinatie van een G-eiwit en een streptavidine-bindende motief, gemaakt door g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken EUROSARF voor het sturen van gist TAP expressie plasmiden. We zijn ook dankbaar voor redactionele hulp van Ryan Labadens. Dit werk werd ondersteund door een NIH / NINDS subsidie (R01NS070962) naar CW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
