Identifikation af protein-protein interaktion i<em> Drosophila</em> Voksen Heads af Tandem Affinitetsrensning (TAP)
Summary
Drosophila er berømt for sin kraftfulde genetisk manipulation, men ikke for sin egnethed dybdegående biokemisk analyse. Her præsenterer vi en TAP-baseret procedure til at identificere interagerende partnere i ethvert protein af interesse fra fluen hjernen. Denne procedure kan potentielt føre til nye muligheder for forskning.
Abstract
Genetiske skærme udført ved hjælp af Drosophila melanogaster (bananflue) har foretaget talrige milepæls opdagelser i fremskridt på biologiske videnskaber. Imidlertid blev brugen af biokemiske skærme med henblik på at udvide viden fra genetiske analyser udforsket nylig. Her beskriver vi en metode til at rense det protein kompleks, der forbinder med noget protein af interesse fra voksne flyve hoveder. Denne fremgangsmåde drager fordel af Drosophila GAL4/UAS systemet til at udtrykke et bait-protein fusioneret med et Tandem Affinitetsrensning (TAP) tag i flyve neuroner in vivo og derefter gennemfører to runder af oprensning under anvendelse af en TAP fremgangsmåde svarende til den, der oprindeligt blev etableret i gær 1 at rense interagerende protein kompleks. Ved afslutningen af denne procedure, er en blanding af flere protein komplekser opnået hvis molekylære identiteter kan bestemmes ved massespektrometri. Validering af kandidat proteinerne vil drage fordel af resource og let at udføre tab af funktion studier i fluer. Lignende metoder kan anvendes på andre flyve væv. Vi tror, at kombinationen af genetiske manipulationer og dette proteomisk tilgang i gylp modelsystemet rummer et enormt potentiale til at tackle grundlæggende problemer inden for neurobiologi og videre.
Introduction
Definition af molekylære veje eller netværk, der medierer en bestemt biologisk proces er en af de ultimative mål for biomedicinsk forskning. Flyve genetikere har stolet tungt på forward genetik, især modifikator genetiske skærme (både forstærker og suppressor skærme), at identificere faktorer, der arbejder sammen, parallelt med, eller opstrøms eller nedstrøms for et gen af interesse. Men forward genetik skærme ofte gange undlader at identificere væsentlige gener, der, når muteret, forårsager dødelighed i de tidlige udviklingsstadier, eller gener med funktionel redundans og kompensation, hvis tab af funktion kun forårsage subtile defekter, der er svære at score. En måde at overvinde denne vanskelighed er at screene for direkte interaktioner af protein-protein. For mere end et årti, en voksende liste af biokemiske metoder, herunder gær to-hybrid, fagvisning, kemisk krydsbinding, Co-IP, Tandem Affinitetsrensning (TAP) osv. er blevet anvendt til at undersøge protein-protein-interaktioner. Hver af disse metoder har sit eget sæt af styrker og svagheder i forhold til sensitivitet og specificitet. Blandt dem, TAP-metoden muliggør påvisning af fysisk interaktion under nær fysiologiske betingelser bevarer specificitet og konsekvens 2 og omfatter evnen til at udvide til high-throughput analyse 3,4.
TAP Metoden blev oprindeligt udviklet i gær ved Rigautand kolleger 1. I denne metode, er et protein af interesse udtrykkes med en TAP tag. TAP tag huser to uafhængige affinitetsbindingsfremgangsmåde domæner: et Protein et domæne, der binder sig til IgG og en calmodulin-bindende domæne. De to domæner er adskilt af en TEV (Tobacco Etch Virus) spaltningssted. En sådan kombination giver mulighed for to uafhængige runder af affinitet udrensninger i tilstrækkelig grad at reducere uspecifikke bindinger og berige specifikke bindinger 1. Til dette eksempel, TAP-metoden er en meget kraftfuld method for at identificere vivo vekselvirkningen mellem et givet protein, skønt der overudtrykker det exogene protein kan gøre det mere tilbøjelige til at associere med proteiner, der normalt ikke kompleks med dets endogene modstykke. Siden sin udvikling, har TAP-metoden været anvendt i mange andre systemer, herunder celle-kultur-baserede systemer 5,6 og andre in vivo modelsystemer 6-9. Her beskriver vi en tilpasning af TAP-metoden i Drosophila. Vi først generere pUAST-NTAP og pUAST-CTAP vektorer til at lette kloning og fusion af TAP tag til enten N-eller C-terminalen af genet af interesse. UAS-TAP-mærkede transgen udtrykkes derefter i nervesystemet under kontrol af en neuronal GAL4 driver 10. Dernæst vil et stort antal voksne flyve hoveder skal indsamles, som har et højt indhold af neurale celler og er nemme at adskille fra andre dele af kroppen efter frysning baseret på størrelsesforskelle. De voksne hoveder er homogeniseret og ryddet by sekventielle centrifugeringer og supernatanten er genstand for en TAP, der er beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tandem affinitetsrensning (TAP)-metoden giver en dobbelt rensning protokol, der tillader isolation og berigelse af protein komplekser gennem to uafhængige affinitetsoprensnings trin. Udformningen af TAP-tag er ikke begrænset til, hvad der er præsenteret i denne protokol, andre proteinstoffer bindende domæner og motiver er også gældende, hvis buffer betingelser er tilpasset. Et godt eksempel på andre TAP tags er GS-TAP tag, en kombination af et G-protein og et streptavidin-bindende motiv, designet af Giulio …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker EUROSARF til at sende os gær TAP ekspressionsplasmider. Vi er også taknemmelige for redaktionel hjælp fra Ryan Labadens. Dette arbejde blev understøttet af en NIH / NINDS tilskud (R01NS070962) til CW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
