Les ganglions lymphatiques sont les tissus immunologiques qui orchestrent la réponse immunitaire et constituent une cible critique pour les vaccins. Des biomatériaux ont été utilisés pour mieux cibler les ganglions lymphatiques et contrôler l’administration d’antigènes ou d’adjuvants. Cet article décrit une technique combinant ces idées pour injecter des particules de polymère biocompatibles dans les ganglions lymphatiques.
La génération de la réponse immunitaire adaptative repose sur le drainage efficace ou le trafic de l’antigène aux ganglions lymphatiques pour le traitement et la présentation de ces molécules étrangères aux lymphocytes T et B. Les ganglions lymphatiques sont ainsi devenus des cibles critiques pour les nouveaux vaccins et immunothérapies. Une stratégie récente pour cibler ces tissus est l’injection directe des ganglions lymphatiques des composants solubles du vaccin, et les essais cliniques impliquant cette technique ont été prometteurs. Plusieurs stratégies de biomatériaux ont également été étudiées pour améliorer le ciblage des ganglions lymphatiques, par exemple, en accordant la taille des particules pour un drainage optimal des particules vaccinales de biomatériaux. Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode qui combine l’injection directe des ganglions lymphatiques avec des particules de polymère biodégradables qui peuvent être chargées d’antigène, d’adjuvant ou d’autres composants vaccinaux. Dans ce procédé, les microparticules polymères ou nanoparticules sont synthétisées par un protocole d’émulsion double modifié intégrant des stabilisants lipidiques. Les propriétés des particules(p. ex. taille, charge de la cargaison) sont confirmées par diffraction laser et microscopie fluorescente, respectivement. Les ganglions lymphatiques de souris sont ensuite identifiés par l’injection périphérique d’un colorant traceur non toxique qui permet la visualisation du site d’injection cible et le dépôt ultérieur de particules de polymère dans les ganglions lymphatiques. Cette technique permet un contrôle direct des doses et des combinaisons de biomatériaux et de composants vaccinaux administrés aux ganglions lymphatiques et pourrait être mise au point dans le développement de nouveaux vaccins à base de biomatériaux.
Les ganglions lymphatiques (LN) sont les centres de commandement du système immunitaire. À ce site immunologique, les cellules présentatrices d’antigènes amorcent les lymphocytes naïfs contre les antigènes étrangers spécifiques pour activer les réponses immunitaires cellulaires et humorales. Les LN sont ainsi devenus une cible attrayante pour l’administration de vaccins et d’immunothérapies. Malheureusement, la plupart des stratégies vaccinales entraînent une administration inefficace et transitoire d’antigènes et d’adjuvants au tissu lymphoïde1. Les approches qui améliorent le ciblage et la rétention des composants du vaccin dans les IAA pourraient donc avoir un impact significatif sur la puissance et l’efficacité des nouveaux vaccins.
Une stratégie pour contourner le défi du ciblage des LN qui a démontré un grand intérêt pour les nouveaux essais cliniques est l’injection directe, intra-LN (i.LN.)2-4. Ces essais ont utilisé des conseils échographiques pour administrer des vaccins aux LN en tant que simple procédure ambulatoire. Par rapport aux voies d’injection périphériques traditionnelles, cette approche a permis d’épargner considérablement la dose et d’améliorer l’efficacité dans des contextes thérapeutiques, y compris les allergies et le cancer2-4. Ces études ont utilisé l’injection i.LN. de vaccins solubles(c’est-à-dire sans biomatériaux) qui ont été rapidement nettoyés par drainage lymphatique. Par conséquent, des injections multiples- ou des cycles d’injections multiples- ont été administrés pour réaliser ces effets thérapeutiques impressionnants. Une meilleure rétention dans le LN pourrait améliorer l’interaction entre l’antigène et/ou l’adjuvant et les cellules immunitaires, améliorant davantage la puissance de l’amorçage des cellules immunitaires. Ce potentiel est soutenu par des études récentes qui montrent que la cinétique de l’antigène et de l’administration adjuvante joue un rôle essentiel dans la détermination de la réponse immunitaire spécifique générée5-7. De plus, la localisation et la réduction au minimum des doses de médicaments et de vaccins pourraient réduire ou éliminer les effets systémiques, comme l’inflammation chronique.
Les biomatériaux ont fait l’objet d’études approfondies pour améliorer la puissance et l’efficacité des vaccins1,8,9. L’encapsulation ou l’adsorption sur les supports de biomatériaux peut protéger physiquement la cargaison de la dégradation et surmonter les limites de solubilité. Une autre caractéristique notable des transporteurs de biomatériaux, tels que les microparticules ou nanoparticules polymères, est la capacité de cocharger plusieurs classes de cargaison et, par la suite, de libérer ces cargaisons à intervalles contrôlés. Cependant, une limitation importante qui continue d’entraver les vaccins contre les biomatériaux et les immunothérapies in vivo est le ciblage inefficace des cellules immunitaires et le trafic limité vers les ganglions lymphatiques. Par exemple, l’injection périphérique de vaccins contre les biomatériaux par des voies conventionnelles(par exemple intradermiques, intramusculaires) présente généralement un mauvais ciblage du LN, avec jusqu’à 99% du matériel injecté restant au site d’injection4,10. Plus récemment, la taille des porteurs de vaccins biomatériaux a été réglée pour améliorer le trafic préférentiel ou le drainage de ces vaccins vers les LN par le flux interstitiel8,10. Ces progrès ont permis d’améliorer les réponses immunitaires cellulaires et humorales, soulignant l’importance de cibler et d’ingénierie l’environnement du LN pour de nouveaux vaccins.
Cet article présente un protocole de vaccination qui combine des particules de polymère stabilisées aux lipides et l’administration d’i.LN. pour générer des dépôts de vaccins à libération contrôlée5,11. S’appuyant sur des études récentes utilisant des techniques chirurgicales pour i.LN. chez la souris6,7,12,13, nous avons développé une stratégie rapide et non surgicale pour l’injection de vaccins biomatériaux chez les petits animaux5. La combinaison de l’administration i.LN. avec des porteurs de vaccins biomatériaux a puissamment amélioré la réponse des lymphocytes T CD8 dans les 7 jours suivant une seule injection de dépôts de vaccins à libération contrôlée5. Une réponse humorale forte(c.-à-d. titres d’anticorps) a été également générée ; ces deux améliorations étaient liées à une rétention accrue des composants du vaccin dans les ganglions lymphatiques qui était médiée par la libération contrôlée des porteurs de biomatériaux. Fait intéressant, la taille des particules vaccinales a modifié le devenir de ces matériaux une fois dans les LN: les particules à l’échelle nanométrique ont montré une absorption directe accrue par les cellules, tandis que les microparticules plus grosses sont restées dans l’environnement LN extracellulaire et ont libéré une cargaison(par exemple adjuvant) qui a été absorbée par l’antigène résident du LN présentant des cellules5. Ces données suggèrent deux voies qui pourraient être exploitées pour de nouveaux vaccins en contrôlant la taille des biomatériaux injectés i.LN.
Dans cet article, les particules polymères biodégradables stabilisées en lipides (micro- et nano-échelle) sont synthétisées à l’aide d’une stratégie de double émulsion modifiée5,11. Les propriétés des particules sont caractérisées par la diffraction laser et la microscopie. Ces particules sont ensuite injectées directement dans les LN inguinaux identifiés nonchirurgicalement à l’aide d’un colorant traceur commun et non toxique14. L’analyse post-injection des LN par histologie ou cytométrie de flux peut être utilisée pour vérifier la distribution des particules dans l’environnement LN, ainsi que pour surveiller l’absorption cellulaire et la rétention des particules au fil du temps. Pour les protocoles détaillant le traitement histologique et la cytométrie en flux, les lecteurs sont renvoyés aux articles récents de JoVE et aux rapports de revue15-22. Les résultats typiques démontrent le ciblage local de ces dépôts par LN qui pourraient être exploités pour obtenir des réponses immunitaires puissantes et efficaces ou pour adapter l’immunité aux agents pathogènes cibles.
La technique décrite dans ce protocole permet l’administration contrôlée des vaccins aux LN et aux cellules présentatrices d’antigène ln-résidentes. La cargaison encapsulée de biomatériaux peut être localisée dans le réseau local, ce qui permet de manipuler les doses d’un ou de plusieurs types de cargaisons livrées au microenvironnement du réseau local. Il a été démontré que la localisation et la libération contrôlée des particules de polymère génèrent une puissante réponse immunitaire cellulaire et humorale à des doses significativement plus faibles que les approches conventionnelles. De plus, grâce à la manipulation de la taille du support de biomatériaux, le mode primaire de traitement cellulaire peut être modulé entre l’absorption directe de nanoparticules ou la libération de cargaison extracellulaire à partir de microparticules plus grandes5. Ces résultats établissent la faisabilité de l’administration de biomatériaux i.LN. en tant que plate-forme pour l’administration de vaccins thérapeutiques.
La synthèse de particules PLGA par émulsion/évaporation de solvant a été largement utilisée dans les applications d’administration de médicaments23,24. Ainsi, les défis potentiels associés à cette technique sont principalement liés à l’identification et au dépôt réussis des vaccins dans le site cible du nouveau-n°c. Bien que l’utilisation du colorant traceur facilite la visualisation des LN inguinaux ciblés, la taille et la profondeur de la cible sous la peau sont petites. Ainsi, les auteurs recommandent d’allouer du temps et des souris pour pratiquer la préparation et les injections de souris. Pendant la préparation de l’animal(c’est-à-dire le rasage et l’application d’un dépilatoire), il faut veiller à ne pas couper les souris sur la face ventrale de l’animal où l’angle de la jambe avec l’abdomen rend la peau plus sujette aux blessures causées par les tondeuses. De plus, tous les dépilatoires doivent être enlevés avec de l’eau tiède pour empêcher les animaux d’ingérer la crème pendant le comportement normal de toilettage. Pour pratiquer les injections de LN, une concentration plus élevée de colorant traceur peut être administrée et les animaux de pratique peuvent être euthanasiés, puis injectés plusieurs fois. Après l’injection, les souris peuvent être nécropsiées et la taille des LN provenant d’animaux injectés peut être comparée à celle d’un LN témoin non injecté. Une limitation de cette technique est la limite physique du volume d’injection qui peut être chargé dans la structure LN. Notre protocole suggère un volume d’injection de 10 μl chez la souris, bien que d’autres études aient rapporté des volumes d’injection plus importants au moins aussi élevés que 20 μl.13 Cependant, l’administration directe de vaccins par injection i.LN. permet une réduction spectaculaire de la dose, de sorte que la fonction de ces vaccins ne devrait généralement pas être limitée par des contraintes de volume.
Comme nous l’avons mentionné, la modification de la propriété physique des particules(c.-à-d. la taille) est un mécanisme efficace pour modifier la voie ou les résultats induits par les biomatériaux et les cargaisons encapsulées dans le tissu LN. Le protocole d’évaporation émulsion/solvant peut facilement être modifié pour modifier les propriétés physiques ou chimiques telles que la charge ou la fonctionnalité de surface, et le taux de biodégradation/libération de la cargaison23,24. Par exemple, la cinétique de libération peut être réglée par des compositions polymères alternatives, et la fonction de surface peut être modifiée à l’aide de compositions lipidiques modifiées ou de poly(alcool vinylique). La cargaison chargée en particules peut être facilement manipulée pour contenir différents antigènes ou adjuvants pour les agents pathogènes cibles. L’avantage de cette approche est obtenu grâce à la combinaison de la livraison i.LN. avec la mainlevée locale et contrôlée de la cargaison à partir de biomatériaux. Cette synergie établit une plate-forme qui peut être exploitée pour générer efficacement des réponses immunitaires adaptatives à l’aide de doses infimes et avec des effets secondaires non spécifiques / systémiques réduits.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé en partie par la fondation PhRMA et un prix de recherche et d’érudition de l’Université du Maryland, College Park. Nous remercions le Professeur Darrell Irvine pour son soutien aux travaux initiaux menés dans le cadre de l’achèvement de « l’ingénieriein situ du microenvironnement ganglionnaire par injection intranodale de particules polymères libérant des adjuvants ». 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |