تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة
Summary
نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.
Abstract
الدهون والبروتينات في الخلايا حقيقية النواة يتم تبادل مستمر بين المقصورات الخلية، على الرغم من أن هذه تحتفظ تكوينها مميزة وظائف على الرغم من مرور interorganelle الجزيئية مكثفة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي وسيلة قوية لدراسة البروتين والدهون التنقل والاتجار في الجسم الحي في بيئتهم والفسيولوجية. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP) وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التصوير الخلية الحية لدراسة الاتجار داخل الخلايا عن طريق إكسو التقامي المسار، والاستمرارية بين العضيات أو subcompartments، وتشكيل مجمعات البروتين، والبروتين التعريب في microdomains الدهون، والتي يمكن ملاحظتها في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. القيود المفروضة على هذه المناهج هي أساسا نتيجة لاستخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت، وتشمل سلبياتها المحتملة مصطنعة الإفراط في التعبير عنايون في الخلايا وإمكانية الاختلافات في للطي والتعريب من البروتينات الموسومة والأم. أخيرا، وكما الحد من قرار المجهر الضوئي (حوالي 200 نانومتر) لا يسمح التحقيق في هيكل غرامة من ER أو subcompartments المحددة التي يمكن أن تنشأ في الخلايا تحت الضغط (أي نقص الأكسجة، وإدارة المخدرات، والإفراط في التعبير من عبر الغشاء البروتينات ER المقيم) أو في ظل ظروف مرضية، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مثقف مع التركيبية يحلل على أساس نقل الإلكترون المجهري.
Introduction
اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ومشتقاته الطيفية، وتطور مواز من مضان المجهري، وفتحت آفاقا جديدة تماما للتحقيق في سلوك البروتين في الخلايا. تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP)، والتي هي ممكنة بسبب القدرة الذاتية للfluorophores لإطفاء مضان بهم تحت إضاءة مكثفة، تقوم على مبائر التصوير الخلية الحية واستخدام transfected البروتينات الفلورية الانصهار 1-3. وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ليس فقط توطين البروتينات، ولكن أيضا قدرتهم على التنقل والنقل الحويصلي، والتي يمكن أن تكشف عن أدلة مهمة بشأن وظيفتها 4.
ميزة فريدة من الخلايا حقيقية النواة هو وجود حجرات داخل الخلايا التي تحتوي على الدهون والبروتين التراكيب محددة. على الرغم من العضيات هي isolat جسدياإد، فإنها تحتاج إلى التواصل مع بعضهم البعض وتبادل المكونات الجزيئية من أجل الحفاظ على التوازن الخلوية. تضمن مسار إفرازية أن البروتينات والدهون توليفها في ER وصول إلى الوجهة النهائية الصحيحة التي تمارس وظيفتها. يمكن أيضا أن تكون متصلا عضيات داخل الخلايا عن طريق مواقع الاتصال الديناميكية التي تسمح الجزيئات (الدهون) التي يتم تبادلها مباشرة بين المقصورات. علاوة على ذلك، العديد من البروتينات قد لتجميعها في مجمعات مغايرة التغصن كبيرة أو المرتبطة بالأنواع الدهون محددة (الطوافات الدهنية / microdomains) لكى تصبح نشطة وظيفيا أو ليتم نقلها إلى وجهتها النهائية. كل هذه الجوانب البيولوجية تؤثر بشكل كبير على الخصائص الحركية للبروتينات، وبالتالي يمكن أن يتم التحقيق بشكل مناسب عن طريق التقنيات الموضحة أدناه.
وقد استخدمت على نطاق واسع مجموعتنا FRAP والوجه جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني من أجل دراسة الهندسة المعمارية لائحة وشبه المختلفةالمجالات. لائحة هي المحطة الأولى من مسار إفرازية، ويلعب دورا رئيسيا في البروتين والدهون الفرز 5. بل هو عضية ديناميكية للغاية التي تعكس وظائف عديدة ومختلفة (أي البروتين والدهون والاتجار الحيوي والبروتين للطي، كا 2 + تخزين والإفراج عنهم، والتمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا) نطاقات فرعية متميزة. ومع ذلك، على الرغم من أنها شكليا، مكانيا، ومتميزة وظيفيا، وهذه المجالات هي مستمرة مع بعضها البعض، ويمكن تعديل الوفرة النسبية في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. أشهرها والمجالات عادة منفصلة مكانيا من ER هي المغلف النووية، وER ناعمة وخشنة، ولكن نحن وآخرون أظهرت أن هناك هياكل ER مع بنية أكثر تفصيلا وتنظيم ثلاثية الأبعاد في مختلف أنواع الخلايا و الأنسجة تحت الظروف الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن يتسبب من خلال محفزات المجهدة مثل نقص الأكسجة، المخدراتالإدارة، أو الإفراط في التعبير عن-ER المقيمين البروتينات عبر الغشاء 2،6 (والمراجع فيه).
كما أننا أظهرنا مؤخرا وجود مثل هذه الهياكل في نماذج خلية من الأمراض التي تصيب الإنسان 1،7. تنشأ من صهاريج مكدسة من ER على نحو سلس، قدمت لهم اسم الجماعية من الشبكة الإندوبلازمية الملساء تنظيم (OSER) في عام 2003 6، على الرغم من أنها معروفة أيضا باسم karmellae، صفاحات، وبلوراني ER على أساس الهندسة المعمارية الخاصة بهم والتي، مثل بهم الحجم، ويمكن أن تختلف. بعد و transfected الخلايا مع GFP تنصهر إلى المنطقة عصاري خلوي من (TA) البروتينات-ER المقيمين (د EGFP-ER) رست الذيل، والميل dimerizing ضعيفة من GFP في العابرة يغير بشكل كبير من تنظيم وهيكل ER. وأظهرت التجارب FRAP وFLIP أن د EGFP-ER هو حر لنشر ضمن OSERs، وحقيقة أنه ينتقل من لائحة شبكي لOSER والعكس بالعكس <م /> يشير إلى أن المجاميع مستمرة مع شبكي ER المحيطة بها. وقد سمح لنا التحليل التركيبية لربط البيانات مضان مع وصفا مفصلا لOSER العمارة وتنظيم على مستوى النانو: تصنع دائما OSERs تتكون من أكوام من صهاريج تقرن من ER نحو سلس ولكن قد يكون لها أشكال مختلفة من التنظيم المكاني، مثل ترتيب بانتظام الجيبية صفائف أو جدلات، أو سداسية "بلوراني" صفائف أنبوبي. هذه تؤدي إلى إعادة ترتيب الأشكال التضاريسية مكعب 8 الذي، كما تم العثور في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية 9 والضغوط التالية مثل نقص الأكسجة 10، 11 العلاج من تعاطي المخدرات، والسرطان 9، قد تنطوي على إمكانات كبيرة كعلامات التركيبية.
بعد هذه المظاهرة الأولى باستخدام GFP البروتينات الانصهار، استخدمنا تجارب التصوير لتحليل انتشار المجالات ER استجابة للعلاجات الدوائية 12، ASSESS ميل البروتينات الفلورية لoligomerise 13 في الخلايا، والتحقيق في دور متحولة، ALS المرتبطة البروتين TA في تشكيل المجاميع داخل الخلايا ER المنشأ التي قد تكون ذات صلة 1،8 المرضية لها. فقد قيل أن تشكيل المجاميع داخل الخلايا (والذي يحدث في كثير من الأمراض العصبية 14) قد تكون آلية وقائية تهدف إلى منع التفاعلات بين البروتينات متحولة السامة ومكونات الخلية المحيطة 15.
ما يلي هو وصف لمجموعة من الأساليب المجهر الضوئي والإلكترون عن التحقيق الذي يبني-C محطة تندس المجالات مسعور في غشاء من لائحة، وتحليل سلوكهم دينامية وآثار على مدى تعبير على نطاق ER الهندسة المعمارية في الخلايا المستزرعة (انظر الشكل 1 لمخطط انسيابي للبروتوكول التجريبية).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت البروتوكولات والنهج التصوير وصفها في هذه الورقة للتحقيق في التوزيع والتنقل من transfected TA البروتينات الفلورية المقيمين في لائحة من الخلايا الحية. قمنا بتحليل أيضا تأثير الإفراط في التعبير من هذه البروتينات على بنية هذا الحيز التحت خلوية من خلال التحليلات ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لFONDAZIONE Filarete على مساعدتها ودعمها في نشر هذا المقال. نود أيضا أن نشكر سنترو دي EUROPEO Nanomedicina لاستخدام TECNAI G2 المجهر الإلكتروني النافذ.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
