タンパク質A膜吸着体と合理化されたワークフローを用いたキメラヒトFc発現タンパク質の単離と特性評価
Summary
プロテインAアガロースビーズパックカラムを用いた従来のアフィニティクロマトグラフィーと比較して、プロテインA膜吸着体は、抗体およびその他のFc断片発現タンパク質の実験室規模の単離を大幅に高速化することができます。適切な分析と定量化方法により、タンパク質処理がさらに加速し、20時間以上の作業時間ではなく、1営業日で分離/特性解析を完了できます。
Abstract
細胞培養上清および溶解細胞溶液からの生体分子の工業的規模への実験室規模の精製は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することができる。多孔質タンパク質Aアガロースビーズを使用したアフィニティークロマトグラフィーは、IgGのFc断片を発現する抗体および組換えタンパク質の実験室規模分離の最も一般的な方法であるが、時間とコストのかかるプロセスであり得る。時間と財務上の制約は、希薄溶液から数百マイクログラムからミリグラムのタンパク質を回収しなければならない小さな基礎科学ラボでは特に困難ですが、バイオ分離の専門知識を持つ高圧液体送達システムや人員へのアクセスが不足しています。さらに、製品の定量化と特性評価は、複数の稼働日にわたって処理時間を過度に長くし、費用(消耗品、賃金 など)を膨らませる可能性があります。したがって、Fcフラグメントを保有する抗体および他のタンパク質の検査尺度の分離および特性評価には、迅速で安価でありながら効果的なプロトコルが必要です。そのために、20時間以上の作業時間を必要とする従来の方法とは対照的に、経験の限られた技術スタッフが9時間未満(約1作業日)、4時間で完了できるプロトコルを考案しました。ほとんどの必要な装置は標準的な生物医学、生物化学、および(生物)化学工学の実験室ですぐに利用でき、すべての試薬は市販されている。このプロトコルを実証するために、細胞培養上清からヒトFc(Gal-1hFc)に融合したキメラマウスガレクチン-1がタンパク質A膜吸着体を用いて単離した代表的な結果が提示される。精製Gal-1hFcを迅速なウェスタンブロッティング分析手順を用いて定量し、フローサイトメトリーを用いて特徴付けた。合理化されたワークフローは、抗体などの他のFc発現タンパク質に対して変更したり、代替定量法や特性評価方法を組み込むために変更することができます。
Introduction
免疫グロブリンG(IgG)Fc断片を発現する抗体および組換えタンパク質の単離は、細胞培養上清および希薄溶解細胞溶液から、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することができる。基礎科学・工学研究所および産業では、高い財政コストと長い処理時間1〜3にもかかわらず、多孔質タンパク質Aコーティングアガロース、ガラス、またはポリマービーズを詰めたカラムが最も一般的にアフィニティークロマトグラフィーに使用されています。アフィニティクロマトグラフィーは、ラボと産業の両方の設定で最大の費用と処理のボトルネックを表すことを高く評価されています2,4.その結果、プロセストレイン1,2,5-7からの製品全体の回復を犠牲にすることなく、コストと処理時間を短縮するために数多くの改良が開発されています。特に抗体および他のFc発現タンパク質の単離に対して有望なのは、A膜吸着体2,5,7-10のタンパク質Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーである。カラムクロマトグラフィーにおけるFc捕捉は拡散に制限される(すなわち、Fc発現タンパク質は、内部細孔を介して拡散して、大部分のタンパク質Aに到達しなければならない)、カラムを横切る高圧降下を伴い、膜吸着体における大量輸送はバルク対流によって駆動され、拡散制限の回避をもたらす8,9,11,12。また、膜吸着量全体の圧力降下が低く、ビードパックカラム8,9,11,12に比べてより速い灌流流速度が可能となる。したがって、実験室規模の分離のために、膜クロマトグラフィーは、数時間の分離時間を短縮し、カラムクロマトグラフィーと比較して製品のキャプチャを増加させると予測されます。さらに、膜吸着物中のIgG吸着の数学的モデルは8,9,11,12を提案されており、エンドユーザーがラボでの性能を予測できるようにしています。
基礎科学・工学研究室のもう一つのボトルネックは、Fc発現タンパク質の特性化である。しかし、このようなウェスタンブロットを、特性評価アッセイを完了するための適切な方法の選択は、製品のテストに費やす時間を大幅に削減することができます。例えば、不連続緩衝システムにおけるセミドライ移動は、連続緩衝システム13におけるタンク内(湿式)移動の1〜2時間とは対照的に、SDS-PAGEゲルからポリビニルジフルオリジン(PVDF)膜へのタンパク質の電気泳動を数分で達成することができる。
ヒトIgGのFc断片を発現するキメラ融合タンパク質を単離し、特徴付ける迅速、安価、および有効なプロトコルが、本明細書に記載されている。ほとんどの装置は標準的な基礎生物医学、生物学、化学、および(生物)化学工学の実験室ですぐに利用でき、すべての試薬は市販されている。代表的な結果は、マウスガレクチン-1/ヒトFcキメラ融合タンパク質(Gal-1hFc)の単離および特性解析から生成されたが、合理化されたプロトコルは、抗体、Fcフラグメント自体、または他のFc融合タンパク質などのFcフラグメントを有する他の分子の単離に適用することができる。当社の改善は、標準的な方法と比較して、類似または改善された製品の回復を達成しながら、処理時間を劇的に短縮しました(4時間ほどですが、通常は20時間以上の作業時間と比較して〜9時間)。.
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載されたプロトコルは、製品の回収や膨張コストを著しく損なうことなく、ヒトFc(Gal-1hFc)を発現するキメラ融合タンパク質を迅速に単離し、特徴付けるために開発された。合理化されたワークフローの主要なコンポーネントは、分離のためのタンパク質A膜吸着体、およびウェスタンブロッティングによる特性評価のためのセミドリー転送および真空支援免疫ブロットです。
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ルイス・F・デルガディージョ氏(オハイオ大学化学・生体分子工学科)、マシュー・H・ウィリアムズ氏(オハイオ大学化学・生体分子工学科)、フィリベルト・セデノ・ローラン博士(ブリガム・アンド・ウィメンズ病院とハーバード大学医学部)に専門的な技術支援を求めています。著者らはまた、2011年冬のCHE 404/BME 504および秋2012 CHE 4830 /BME 5830学生(オハイオ大学化学・生体分子工学・生物医学工学専攻)に技術的な助言と議論を感謝したいと考えています。この研究は、国立科学財団(NSF)主要な研究計装助成金CBET-1039869(MMB)、NSF CBET-1106118(MMB)、皮膚財団研究助成金A050422(SRB)、国立衛生研究所(NIH)NCI助成金1R15CA161によって支援されました 830-01 (MMB)、NIHキルシュシュタイン-NRSAポスドク・フェローシップF32CA144219-01A1(SRB)、NIH/NCI R01CA173610(CJD)、NIH NCCAM助成金R01AT004628(CJD)。
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
