Isolation og karakterisering af Kimære Human Fc-udtrykke proteiner ved hjælp af Protein A Membrane Adsorbers og en strømlinet Workflow
Summary
Sammenlignet med traditionel affinitetskromatografi ved hjælp af protein A agarose perlepakkede søjler kan protein A-membrane adsorbere betydeligt fremskynde laboratorieskala isolering af antistoffer og andre FC fragment-udtrykke proteiner. Passende analyse- og kvantificeringsmetoder kan yderligere fremskynde proteinforarbejdningen, så isolation/karakterisering kan gennemføres på én arbejdsdag i stedet for 20+ arbejdstimer.
Abstract
Laboratorieskala til industriel rensning af biomolekyler fra cellekultur supernatants og lysed celleopløsninger kan opnås ved hjælp af affinitetskromatografi. Mens affinitet kromatografi ved hjælp af porøse protein A agarose perler pakket i kolonner er velsagtens den mest almindelige metode til laboratorieskala isolering af antistoffer og rekombinant proteiner udtrykke Fc fragmenter af IgG, kan det være en tidskrævende og dyr proces. Tid og finansielle begrænsninger er især skræmmende i små grundlæggende videnskab labs, der skal inddrive hundredvis af mikrogram til milligram mængder af protein fra fortyndede løsninger, men mangler adgang til højtryksvæske leveringssystemer og / eller personale med ekspertise i bioseparationer. Desuden kan produktkvantificering og karakterisering også forlænge behandlingstiden for meget over flere arbejdsdage og oppuste udgifterne (forbrugsvarer, lønninger osv.). Derfor er der brug for en hurtig, billig, men effektiv protokol til laboratorieskalaisolering og karakterisering af antistoffer og andre proteiner, der besidder et Fc-fragment. Til dette formål har vi udarbejdet en protokol, der kan udfyldes af teknisk personale med begrænset erfaring på mindre end 9 timer (ca. en arbejdsdag) og så hurtigt som 4 timer, i modsætning til traditionelle metoder, der kræver 20 + arbejdstid. Det meste nødvendige udstyr er let tilgængeligt i standard biomedicinsk videnskab, biokemi og (bio)kemitekniske laboratorier, og alle reagenser er kommercielt tilgængelige. For at demonstrere denne protokol præsenteres repræsentative resultater, hvor kimær murine galectin-1 smeltet til human Fc (Gal-1hFc) fra cellekultur supernatant blev isoleret ved hjælp af et protein A membran adsorber. Renset Gal-1hFc blev kvantificeret ved hjælp af en fremskyndet vestlig blotting analyseprocedure og karakteriseret ved hjælp af flow cytometry. Den strømlinede arbejdsgang kan ændres for andre Fc-udtrykkende proteiner, såsom antistoffer, og / eller ændres til at omfatte alternative kvantificerings- og karakteriseringsmetoder.
Introduction
Isolering af antistoffer og rekombinante proteiner, der udtrykker immunglobulin G (IgG) Fc fragmenter fra cellekultur supernatants og fortyndet lyserede celleopløsninger kan opnås ved hjælp af protein A affinitet kromatografi. I grundlæggende videnskabs- og ingeniørlaboratorier og industri anvendes kolonner fyldt med porøst protein A-belagt agarose, glas eller polymere perler oftest til affinitetskromatografi på trods af høje økonomiske omkostninger og lange behandlingstider1-3. Det er godt værdsat, at affinitetskromatografi repræsenterer den største udgift og behandling af flaskehals i både laboratorie- og industrimiljøer2,4. Som følge heraf er der udviklet en lang række forbedringer for at reducere omkostninger og behandlingstid uden at ofre den samlede produktgenvinding fra procestoget1,2,5-7. Særligt lovende for isolering af antistoffer og andre Fc-udtrykke proteiner er affinitet kromatografi ved hjælp af et protein A membran adsorber2,5,7-10. Mens Fc indfangning i kolonnekromatografi er diffusionsbegrænset (dvs. at det fc-udtrykkende protein skal spredes ind i og gennem indvendige porer for at nå størstedelen af proteinet A) med højt trykfald over kolonnen, er massetransport i membran adsorbere drevet af bulk konvektion, hvilket resulterer i undgåelse af diffusionsbegrænsninger8,9,11,12. Derudover er trykfaldet på tværs af membranens adsorber lavt, hvilket muliggør hurtigere perfusionsflowhastigheder sammenlignet med perlepakkede kolonner8,9,11,12. For laboratorieskalaisolering forventes membrankromatografi således at reducere isolationstiden med flere timer og øge produktfangst sammenlignet med kolonnekromatografi. Desuden er matematiske modeller for IgG adsorption i membran adsorbere blevet foreslået8,9,11,12, hvilket giver slutbrugerne mulighed for at forudsige ydeevnen i laboratoriet.
En anden flaskehals i grundlæggende videnskab og teknik laboratorier er karakteriseringen af Fc-udtrykke protein. Men, udvælgelse af passende metoder til at fuldføre karakterisering assays, såsom vestlige blots, kan i høj grad reducere den tid, der bruges på produkttest. For eksempel kan halvdry-overførsel i et diskontinuerligt buffersystem udføre elektrofobtisk overførsel af proteiner fra en SDS-PAGE gel til en polyvinyldifluoridin (PVDF) membran i løbet af få minutter i modsætning til 1-2 timers tankoverførsel (våd) overførsel i et kontinuerligt buffersystem13.
En hurtig, billig og effektiv protokol til at isolere og karakterisere et kimært fusionsprotein, der udtrykker et Fc-fragment af menneskelig IgG, er beskrevet heri. Det meste udstyr er let tilgængeligt i grundlæggende biomedicinsk videnskab, biologi, kemi og (bio)kemitekniske laboratorier, og alle reagenser er kommercielt tilgængelige. Selv om repræsentative resultater blev genereret fra isolation og karakterisering af en murine galectin-1/human Fc kimære fusion protein (Gal-1hFc), den strømlinede protokol kan anvendes til isolering af andre molekyler, der besidder en Fc fragment, såsom antistoffer, Fc fragmenter selv, eller andre Fc fusion proteiner. Vores forbedringer reducerede behandlingstiden dramatisk (så få som 4 timer, men mere typisk ~ 9 timer sammenlignet med 20 + arbejdstimer), samtidig med at vi opnåede lignende eller forbedret produktgendannelse sammenlignet med standardmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri blev udviklet til hurtigt at isolere og karakterisere et kimært fusionsprotein, der udtrykker menneskelige Fc (Gal-1hFc), uden at det væsentligt kompromitterer produktgenvinding eller oppustningsomkostninger. Nøglekomponenterne i den strømlinede arbejdsgang er et protein A-membran adsorber til isolation, og halvdryk overførsel og vakuumassisteret immunoblotting til karakterisering af vestlig blotting.
Det dramatiske fald i behandlingstiden for isolation og kara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at takke Mr. Luis F. Delgadillo (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering, Ohio University), Matthew H. Williams (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering, Ohio University), og Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham og Women’s Hospital og Harvard Medical School) for ekspert teknisk bistand. Forfatterne vil også gerne takke Winter 2011 CHE 404/BME 504 og Fall 2012 CHE 4830/BME 5830 studerende (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering og Biomedicinsk Engineering Program, Ohio University) for teknisk rådgivning og diskussion. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI tilskud 1R15CA16 1830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) og NIH NCCAM tilskud R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
