피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서
Summary
동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.
Abstract
피부, 신경과 같은 신경 병증 성 통증은이 같은 일을 센싱뿐만 아니라 병리 생리적 과정의 프로세스에 관여된다. 그들의 근접에 표면의 위치는 그대로 동물을 생활에서 피부 신경 말단의 미세한 영상을 용이하게한다. 다 광자 현미경을 사용하면, 피부 조직의 강한 광 산란 문제를 극복 미세 영상을 얻을 수있다. (주변 감각 신경 포함) 뉴런 네-1 프로모터의 조절하에 EYFP을 표현 기자 형질 전환 마우스는 최대 몇 개월 또는 평생 오랜 기간 동안 개별 신경 종말의 종 연구에 적합하다. 또한, 촬상 용으로 동일한 펨토초 레이저를 이용하여, 이는 신경 섬유의 재구성 연구에 신경 섬유의 매우 선택적 병변을 제조 할 수있다. 여기서, 우리는 생체 내에서 촬상 종 다 광자위한 간단하고 신뢰성있는 프로토콜을 제시마우스 피부의 신경 말단에 레이저 기반 미세.
Introduction
피부 신경 말단 다른 병태 생리 학적 상태에 따라 동적 인 변화를 겪는다. 신경 섬유는 말초 신경 병증이 모톤 신경종 또는 3과 같은 질병의 과정에서 변성 및 재생 또는 재구성의 프로세스를 수행 할 수있다. 외상 후 피부의 신경 말단 역학의 중요한 부분은 손상된 영역의 reinnervation이다. 그러나, 신경 종말의 조사를위한 일반적인 방법은 진행중인 프로세스 4에 실시간 정보를 결여 생체의 조직 학적 절편이다. 유 전적으로 인코딩 된 형광 마커를 사용하여, 따라서 구조적 변화에 훨씬 더 풍부하고 관련 정보를 획득하는, 살아있는 동물의 피부에있는 신경 말단을 추적 할 수있다. 피부 신경 종말의 조사는 종래의 형광 현미경이 있지만, 피부 조직의 강한 광산란 강하게 품질을 저해하여 가능하다데이터 5를 인수했다. 다 광자 현미경에 의한 유일한 목적의 초점으로부터의 형광 발광을 초래 여기 광의 광자의 에너지의 비 – 선형 합에 강하게 산란 조직의 고해상도의 영상을 획득하는 것을 허용한다. 이 효과는 피부 조직 (6)에서의 측정 결과에 대한 강력한 침투 깊이의 증가와 신호 대 잡음 비의 향상을 이끈다. 이미징을위한 동일한 레이저를 사용하면, 신경 섬유 (7)의 선택적인 박리를 제조 할 수있다. 다음의 프로토콜에서는 선택적 레이저 병변 시판 다 광자 현미경 시스템을 사용하여 결합 된 리포터 유전자 변형 마우스에서 생체 내 피부 신경 종말의 길이의 촬상 방법을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 동영상 프로토콜에서는 단일 신경 말단의 비 침습적 종 이광자 촬상 방법을 보여준다.
피부 신경 밀도의 역학 건선 및 말초 신경 병증이, 등의 질환과 외상 구에 영향을받습니다. 두 광자 이미징은 콜라겐 매트릭스에있는 신경 섬유 구조의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 리포터 유전자 변형 마우스의 사용은 신경 섬유의 염색에 관한 문제를 방지하는 데 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 재정 지원에 대한 기술 지원, CIMO 재단과 FGSN에 대한 Neurotar (주)에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
