Summary
Vanligvis brukes, er svært tilgjengelig metoder for å undersøke celle migrasjon og invasjon in vitro beskrevet. Den første metoden er den celle lukking av sår assay som måler celle motilitet. Den andre metoden er en Transwell migrering og invasjon assay som vurderer kjemotaktisk og invasive antall celler.
Abstract
Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.
Introduction
Motilitet er en viktig funksjon i levende celler. Celle migrasjon er involvert i den oppfatning av livet, embryoutvikling, immunrespons, og mange patologiske prosesser som kreft metastasering og betennelse 1-9. Derfor metoder for å studere celletrekkadferden er svært nyttige forskning verktøy for et bredt spekter av disipliner i biomedisinske fag, biologi, bioteknologi og relaterte felt.
Studiet av celle migrasjon i kreftforskning er av spesiell interesse som den viktigste dødsårsaken hos kreftpasienter er knyttet til metastatisk progresjon. For cancer for å spre og spre seg i hele kroppen, må kreftcellene migrere og invaderer gjennom ekstracellulære matriks (ECM), intravasate inn i blodsirkulasjonen, feste til et fjernt sted, og til slutt extravasate å danne fjernt foci 1,10-12. Forskjellige biologiske metoder kan anvendes for å studere disse hendelsene i detalj. Den cellekultur sår-lukke end den Transwell migrasjon og invasjon analyser er mye brukt i det vitenskapelige miljøet 1,10. Disse testene kan gi den nødvendige data som kan gi rom for en forståelse av hvor godt en bestemt celletype kan spontant migrere eller svare på en chemo-tiltrekkende og retnings migrere mot det. Flere trekk fenotyper har blitt beskrevet. Celler kan migrere i en enkelt celleform, slik som vist i mesenchymale eller amoeboid lignende bevegelse eller ved flercellet bevegelse merket kollektive migrasjon eller celle streaming 13.. Metoden for bevegelse benyttes i bevegelige celler kan lett observeres ved hjelp av cellekultur lukking av sår assay.
Blant de tallrike metoder for å studere cellemigrering, er cellen lukking av sår assay av en av de enkleste. Denne metoden er nyttig for å bestemme migrasjons evne av hele cellemassene. Når tatt et steg videre, kan det brukes til å observere enkelte cellens morfologiske kjennetegn under trekket 14. Etter analyse av sårlukking mange fenotyper kan bli avslørt. Måling lukket avstand over tid når man sammenligner med en kontrollgruppe kan avsløre spesifikke migrasjons endringer eller en svekket vandrende fenotype som var ukjent tidligere. Videre kan enkelt celle lamellipodium formasjon, hale tilbaketrekkingen, og retningsbevegelse gi ledetråder for hva som kan bli svekket eller styrket i cellene av interesse 14.
Den Transwell migrering og invasjon assays kan bli brukt til å analysere evnen av enkelt-celler til å svare på forskjellige retnings kjemo-tiltrekningsmidler enten de er kjemokiner, vekstfaktorer, lipider, eller nukleotider 4,5,8,15,16. Det kan også vurdere differensial trekkende evne på grunn av over-ekspresjon av en reseptor 1,14. Disse assays kan også bli brukt for å identifisere og karakterisere de viktige regulatorer av cellemigrasjon slik som Rho familie av små GTPases 2. Etter disse korte og lett accesatte tester, modusen for cellemigrasjon og evnen av en celle til å invadere inn i en 3-D matrise kan også bli bestemt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migrasjon er et viktig aspekt for å studere i kreftforskning og det kan også bli brukt til utviklings, immunologiske og sårheling studier. Den cellekultur sårlukking assay og Transwell cellemigrering og invasjons analyser viser detaljert informasjon om celle trekkende virkemåter, og kan brukes til å undersøke de molekylære mekanismer for cellemigrasjon 1,2,10,14. Vår studie brukt disse cellemotilitet analyser for å bestemme migrasjon hastighets-og invasjons egenskapene til en B16F10 melanomacel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia & Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
