心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

Summary

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。

Abstract

以前の研究は、細胞送達は、サイトカインおよび心臓組織の血管再生および細胞生存を増加させる因子の放出によって心機能改善を促進することが示された。また、さらなる観察は、例えば、心臓幹細胞、間葉系幹細胞およびcardiospheresなどの特定の幹細胞は、心筋細胞、平滑筋細胞および内皮細胞に分化することによって周囲の心筋層内に統合する能力を有していることが明らかになった。

ここでは、確実に免疫枯渇マウ​​スの左心室壁への非収縮細胞を送達するための材料および方法を提示する。この顕微手順の顕著なステップは、麻酔および鎮痛注射、気管内挿管、胸を開いて、無菌の30ゲージの針、精密マイクロリットル注射器で細胞の心と配信を露出させるために、切開を伴う。

心臓収穫、embeddiからなる組織処理NG、切片および組織学的染色は、心筋内細胞注入は、小さな心外地域の被害だけでなく、心室壁にを生成することを示した。非収縮細胞は、免疫不全マウスの心筋壁に保持され、心臓の圧力と機械的負荷から保護する可能性線維性組織の層に囲まれた。

Introduction

様々な細胞送達プロトコルは、ヒト患者におけるこの実験手順の効率を翻訳し、有効性及び安全性を目的とした心血管疾患のマウスおよびラットモデルにおいて試験されている。ラット心臓順行³と逆行⁴冠動脈内の細胞注入でも使用することができるのに対し、小型のげっ歯類の心の中で、心筋内細胞送達は、細胞送達^1,2の最も実現可能な方法である。どちらの方法も限界と利点を持っている。冠動脈内経路を介して細胞送達は、グローバルセル³普及^を促進する上で直接的な筋肉内注射の理論上の利点を有するが、それはまた、冠動脈塞栓^3,5を引き起こす危険性を有している。心筋内配達の制限事項は、機械的な損傷、急性炎症、および心筋障害^6,7に関連している。ヒトでは、心臓の修復のための細胞は、心内膜または外科心外膜を通して心筋内注射によって送達されるアプローチまたは冠動脈内動脈ルート⁸による。経血管経路による注射は、急性心筋梗塞および再灌流心筋症患者に適しているが、完全閉塞や影響領土⁹の血管内であまり流れの場合にはできないことがあります。経心または経心外膜注入による心室壁への直接注入は、患者の健康状態に応じて技術的に可能である。実際、経心外膜注射用開胸手術が必要であり、経心ための実行可能な虚血または心筋瘢痕⁹の部位を区別するために必要とされる各患者の電気生理学的マッピングに近づくが、この技術は^、10,11安全であることが示されている。

重要なのは、細胞治療の研究に移植するための最良のセルの選択は、調査中です。短期分析（4週間）は、心臓幹細胞の注入がcardiospheresとして定義することを示した<sアップ> 12または骨髄から¹³サイドポピュレーション細胞瘢痕の大きさおよび細胞死を減少させることによって、心筋梗塞のマウス¹⁴及び¹⁵のモデルラットにおける心機能回復を誘導した。免疫抑制なしのラットの心筋梗塞モデルにおけるcardiospheresの同種移植は、心臓の再生を促進し、安全であることが判明し、内因性の修復機構¹⁵の刺激により心機能を改善しました。心の中Lin-/c-kit +大人の前駆細胞は、in vitroおよびin vivoで自己再生、クローン原性、および多能であることが示され、虚血性ラットの心臓に注射した場合には、障害を受けた心筋壁¹⁶の大部分を再構成していたた導電性の中間サイズの冠状動脈^17を形成する能力。これらの有望なデータがフェーズを煽っIおよびヒトにおけるII臨床試験：自己および同種間葉系幹細胞^（MSC）18の注入は^、19を cardiospheresまたはc-Kitの陽性心臓幹細胞（CSC）虚血性心臓におけるヒト20それぞれは、長期試験において、心機能に有益な効果を示した。それにもかかわらず、大規模な長期追跡及び遡及的メタ分析は、幹細胞療法はなく、予測不可能な結果²¹の範囲内の他、一部の患者に有意な利益を提供することを実証した。それは、これらの制限は、各個人や各疾患のための細胞送達の特定のプロトコルの設計を必要とする可能性があります。

マウスおよびラットモデルにおいて、長期的な研究は、細胞注射は、さらに（12ヶ月）の心機能を改善しなかったことを明らかにした。実際に、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（hESCの-CM）の移植片は主として線維性組織^22,23の層によって宿主心筋から単離した。同様の結果は、梗塞マウス²⁴の中心部に骨格筋芽細胞の心筋内移植後に観察されている。 FurthermoRE、梗塞中心部に機能を維持するために、同種のMSCの長期的な能力は、分化²⁵の後に免疫特権の免疫原性状態への遷移によって制限されてきた。

考察上記で概説した課題と展望を考慮して、我々は、マウスの心筋内注射することによって細胞を送達する方法をここに表示されます。我々は心筋細胞収縮特性のない細胞を宿主の心筋に接続されており、薄い線維性バリアで凝集塊を形成していないことを確認します。いくつかのケースでは、この結果が有利であり得るが、以下の分析は、細胞移植は、同様に機能的に接続された心筋の構造を生成するために変調することができる方法を理解するのに有用であり得る。

Protocol

すべての動物実験は、国際（欧州議会の指令2010/63/EU）と国家（英国内務省、アクト1986）規制に準拠して行った。本明細書に記載の手順は、英国のライセンス当局の下での作業の我々の計画の一部であり、記録の目的のために行われていない。 1。細胞の調製このプロトコルは、デモ用の特定の細胞株（ヒト胎児腎臓HEK293細胞）の調製を記載する。細?…

Representative Results

我々は、細長い心筋細胞（ 図1A）と比較して、玉石状に、それらの異なる形態（ 図1）により心臓の細胞から区別可能であるHEK293細胞を注射した。 HEK293細胞は、それらの増加、核コンテンツ（ 図1A）の可能性が高い心筋細胞（ピンク色）と比較して、ヘマトキシリン色素（青色）に、より反応性であった。さらに、宿主組織から注入された細胞を区別す?…

Discussion

本稿では、我々は、マウスの心の中の細胞の心筋内注入を実行する方法が示されている。この方法論の証明として、我々は、HEK293細胞を使用している。これは、HEK293細胞は任意の細胞治療研究では使用しないので、この原稿の知見は治療的アプローチへの直接変換のための適切ではないことを強調することが重要である。しかしながら、HEK293細胞は収縮性細胞ではなく、他の細胞型に分化転?…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T